[发明专利]一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用

说明书

本发明公开了一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用，所述报告系统以表达载体pLVX‑IRES‑puro为基本骨架，在所述pLVX‑IRES‑puro的启动子后插入目的基因CMA报告序列，所述CMA报告序列包含荧光蛋白、衔接在荧光蛋白N末端的含有五肽基序KFERQ的S‑Tag1、衔接在荧光蛋白C末端的含有五肽基序KDRVQ的S‑Tag2；其中，所述表达载体pLVX‑IRES‑puro的序列如SEQ ID NO.1所示。该报告系统表达效率更高，检测CMA的活性更加灵敏，可用于实时监测CMA在疾病发生发展中的活性变化。

技术领域

本发明属于分子生物学及生物荧光成像技术领域，具体涉及一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统及其应用。

背景技术

分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)是哺乳动物细胞中唯一的选择性自噬类型。它的选择性依赖于分子伴侣蛋白HSC70识别并结合目的蛋白的五肽基序，形成HSC70/底物蛋白复合物，移位至CMA活性溶酶体表面，随后底物蛋白复合物转移到单跨溶酶体相关膜蛋白2A型(LAMP2A)的尾部，触发其组装成多聚体分子转运通道，底物蛋白复合物通过该转运通道到达溶酶体腔进行降解。这种独特的转运机制和对底物的选择性是CMA动态清除蛋白质的基础。

但是，现有的检测分子伴侣介导的自噬活性报告系统表达效率低、对于CMA活性的监测不够灵敏，因此限制了其在CMA中的相关研究应用。因此，亟需一种表达效率更高、检测CMA的活性更加灵敏、准确的报告系统。

发明内容

本发明的目的是克服现有CMA活性报告系统表达效率低、检测不够灵敏的缺陷。

为了达到上述目的，本发明提供了一种检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统，所述报告系统以表达载体pLVX-IRES-puro为基本骨架，在所述pLVX-IRES-puro的启动子后插入目的基因CMA报告序列，所述CMA报告序列包含荧光蛋白、连接在荧光蛋白N末端含有五肽基序KFERQ的S-Tag1、衔接在荧光蛋白C末端含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2；

其中，所述表达载体pLVX-IRES-puro的序列如SEQ ID NO.1所示。

较佳地，所述荧光蛋白包含EGFP、mCherry、Dendra2中的任意一种。

较佳地，所述荧光蛋白是Dendra2，所述Dendra2的序列如SEQ ID NO.2所示。

较佳地，所述报告系统还包含若干个刚性linker，其中，所述含有五肽基序KFERQ的S-Tag1和所述荧光蛋白之间至少连接一刚性linker，所述含有五肽基序KDRVQ的S-Tag2和所述荧光蛋白之间至少连接一刚性linker。

较佳地，所述表达载体pLVX-IRES-puro至少包含复制起始位点Ori、启动子promoter、内部核糖体进入位点序列IRES和/或RRE、非融合抗性标记基因puro、氨苄抗生素抗性基因AmpR、逆转录病毒顺式调节元件HIV-1ψ、3’LTR增强子序列。

较佳地，所述启动子promoter是CMV启动子。

本发明还提供了包含如上任意一项所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的重组细胞系。

较佳地，所述重组细胞系的宿主细胞至少包含小鼠和人的原代细胞、小鼠和人的肿瘤细胞、体外培养的连续细胞系中的任意一种。

本发明还提供了一种如上任意一项所述的检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统的应用，所述检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统用于神经退行性疾病、视网膜退行性病变、癌症、衰老等病理生理过程中实时监测CMA活性的变化。

较佳地，所述检测分子伴侣介导的自噬活性的报告系统用于评估药物及基因改造对CMA活性的干预效果。