[发明专利]一种BCR-ABL突变工程细胞及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种BCR-ABL突变工程细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建pCDH-BCR-ABL-WT野生型质粒；

(2)采用重叠PCR扩增BCR-ABL突变片段；

(3)将步骤(2)得到的BCR-ABL突变片段和步骤(1)得到的pCDH-BCR-ABL-WT野生型质粒双酶切后连接，得到BCR-ABL点突变质粒；

(4)将步骤(3)得到的BCR-ABL点突变质粒包装慢病毒后感染宿主细胞得到BCR-ABL突变工程细胞。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述BCR-ABL点突变质粒包括BCR-ABL-T315L、BCR-ABL-T315Y、BCR-ABL-T315I、BCR-ABL-Q252H/Y253H、BCR-ABL-Y253H/E255K、BCR-ABL-Q252H/T315I、BCR-ABL-Y253H/F317I、BCR-ABL-T315I/F359V、BCR-ABL-D276G/T315L或BCR-ABL-T315L/T319S点突变质粒。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述BCR-ABL点突变质粒包括BCR-ABL-T315L、BCR-ABL-T315Y、BCR-ABL-T315I、BCR-ABL-Q252H/Y253H、BCR-ABL-Y253H/E255K或BCR-ABL-T315L/T319S时，所述重叠PCR进行一次重叠PCR扩增，包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ，所述突变片段Ⅰ以pCDH-BCR-ABL-WT为模板，通过上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-MUTATION-R扩增得到；所述突变片段Ⅱ以pCDH-BCR-ABL-WT为模板，通过上下游引物BCR-ABL-MUTATION-F/BCR-ABL-NotI-R扩增得到；所述第二轮PCR以突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ为模板，通过上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-NotI-R扩增得到，得到BCR-ABL突变片段。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述BCR-ABL点突变质粒包括BCR-ABL-Q252H/T315I、BCR-ABL-Y253H/F317I、BCR-ABL-T315I/F359V或BCR-ABL-D276G/T315L时，所述重叠PCR进行两次重叠PCR扩增；

其中，第一次重叠PCR分别扩增BCR-ABL-Q252H、BCR-ABL-Y253H、BCR-ABL-T315I和BCR-ABL-D276G，第一次重叠PCR包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ，所述突变片段Ⅰ以pCDH-BCR-ABL-WT为模板，通过上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-MUTATION-R扩增得到；所述突变片段Ⅱ以pCDH-BCR-ABL-WT为模板，通过上下游引物BCR-ABL-MUTATION-F/BCR-ABL-NotI-R扩增得到；所述第二轮PCR以突变片段Ⅰ和突变片段Ⅱ为模板，通过上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-NotI-R扩增得到，得到突变片段Ⅲ；

第二次重叠PCR扩增包括第一轮PCR和第二轮PCR；第一轮PCR分别扩增突变片段Ⅳ和突变片段Ⅴ，所述突变片段Ⅳ以所述突变片段Ⅲ为模板，通过上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-MUTATION-R扩增得到；所述突变片段Ⅴ以所述突变片段Ⅲ为模板，通过上下游引物BCR-ABL-MUTATION-F/BCR-ABL-NotI-R扩增得到；所述第二轮PCR以突变片段Ⅳ和突变片段Ⅴ为模板，通过上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-NotI-R扩增得到，得到BCR-ABL突变片段Ⅵ。