[发明专利]一种BCR-ABL突变工程细胞及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种BCR‑ABL突变工程细胞及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。该构建方法包括以下步骤：构建pCDH‑BCR‑ABL‑WT野生型质粒，采用重叠PCR扩增BCR‑ABL突变片段；将BCR‑ABL突变片段和pCDH‑BCR‑ABL‑WT野生型质粒双酶切后连接，得到BCR‑ABL点突变质粒，然后将BCR‑ABL点突变质粒包装慢病毒后感染宿主细胞得到BCR‑ABL突变工程细胞。本发明通过重叠PCR扩增BCR‑ABL突变片段，大大降低了质粒克隆的难度，提高BCR‑ABL点突变质粒中克隆的效率，并将BCR‑ABL突变工程细胞作为体内/体外模型细胞，为白血病药物研发和选择提供重要的思路。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种BCR-ABL突变工程细胞及其构建方法与应用。

背景技术

慢性粒细胞白血病(简称慢粒)，也被称为慢性髓性白血病(Chronic myelogenousleukemia，CML)，其典型表现为白细胞增高和脾脏肿大。1960年科学家在该病患细胞中发现了费城染色体，该染色体是由9号与22号染色体易位形成的，这种易位导致了9号染色体BCR和22号染色体ABL基因融合。BCR-ABL融合基因编码了BCR-ABL融合蛋白，又根据融合位点差异，主要分为P210KD、P190KD和P230KD三种。BCR-ABL作为一种融合基因，它定位在细胞质内，融合后非受体酪氨酸激酶ABL蛋白N端的肉豆蔻酰肽丢失，致使了ABL激酶域上的变构位点缺失，进一步导致了SH3、SH2与激酶域无法交联抑制自身活性，于是BCR-ABL激酶持续激活。这种异常激活，驱动了ABL下游RAS、PI3K/AKT、JAK/STAT等多条信号通路，使得正常细胞恶性转化及增殖，造血细胞失去正常的凋亡功能，不再依赖于造血生长因子等，进而促使肿瘤的发生发展。BCR-ABL已经在20～30％的ALL及超过90％的CML患者中检测到，其也被作为白血病尤其是慢性粒细胞白血病的重要治疗靶点。

在首次发现慢粒之后的百余年间，其治疗药物从砷剂、脾区照射发展到白消安、羟基脲、干扰素、骨髓移植等，直到人们发现BCR-ABL在慢粒发病机制中的关键意义，科学家们开始研究小分子药物用于慢粒的治疗，最终发明了酪氨酸激酶抑制剂(TKI)靶向药物。至今为止，已有多种TKI批准上市并允许运用在CML的治疗中，且证实可使患者长期总生存率达90％。包括BCR-ABL的第一代的TKI—Imatinib(伊马替尼，2001上市)，作为一线治疗选择，显著提高了患者生存率；第二代TKI—Dashatinib(达沙替尼，2006上市)、Nilotinib(尼洛替尼，2007上市)等，它们能克服除T315I以外的大部分突变(L248V、G250E、Q252H等)，从而解决了Imatinib治疗过程中由靶蛋白编码基因突变导致的BCR-ABL依赖性耐药；但随着T315I位点突变的出现，病患对第二代药物重新出现耐药；经过研发，第三代TKI—Ponatinib(普纳替尼，2012上市)，它能克服包括T315I在内的多种突变，给病患带来福音，但随着BCR-ABL基因新位点的突变等原因，对第三代TKI-Ponatinib耐药的现象在临床上重新出现；2021年，第四代TKI—Asciminib(Scemblix，ABL-001)上市，它区别于前三代ATP竞争性抑制剂，是一种变构抑制剂，可以通过改变蛋白结构进而影响蛋白功能，其也能克服包括T315I在内的多种突变绝大多数患者都可以回归正常的工作和生活。但遗憾的是仍有一部分患者不能达到理想缓解效果(原发性耐药)或缓解后复发(继发性耐药)。耐药机制可分为BCR-ABL依赖性和非依赖性，其中主要为BCR-ABL依赖性耐药，这可能由于基因突变导致了自身蛋白构象改变，拥有空间位阻或形成其它区域结合了TKI。而对于是否由这些突变类型引发了耐药，是否有其它用药方式可以克服这些突变尚不清楚，这就需要有携带这些突变的工程细胞株作为模型进行科学研究。

携带特定癌基因的工程细胞株的构建与筛选并不容易，提高工程细胞株的构建和筛选效率是研究特定癌基因的重要内容之一，一种好的构建与筛选方式可以节省大量成本，提高科学研究速率；同时，BCR-ABL工程细胞的成功构建，可以为BCR-ABL靶向药物的开发及测试提供便利；也可作为新的靶向药的大规模筛选提供筛选平台。

发明内容