[发明专利]基于电化学技术的小分子-DNA结合常数计算方法

说明书

本发明公开了基于电化学技术的小分子‑DNA结合常数计算方法，属于电化学分析技术领域，包括如下步骤：(1)制备DNA修饰电极；(2)测定电化学信号；(3)确定污染物小分子检测浓度；(4)构建标准曲线；(5)测定结合常数。本发明通过小分子与界面修饰的DNA发生作用，可使DNA膜层的电化学性能发生变化，从而实现结合能力及结合常数分析。该方法具有操作简单、快速、高灵敏、低成本、抗干扰性强等优点，对完善现有结合常数K测定技术具有重要意义和较好的应用价值。

技术领域

本发明属于电化学分析技术领域，具体涉及基于电化学技术的小分子-DNA结合常数计算方法。

背景技术

环境中的污染物，特别是有机、有毒污染物，如多环芳烃、多氯联苯、有机氯农药、有机染料等，具有生物可累积性，对生态系统和人类健康危害极大。研究表明，污染物通过直接接触、呼吸、饮食等多种途径进入人体，并可在人体内蓄积而产生毒害作用，同时可通过活化作用(人体新陈代谢作用、酶降解作用)等转变为生物活性更高、毒性更强的中间体/衍生物，这些活性中间产物可与生物大分子(蛋白质、脂类、DNA等)相互作用造成大分子结构与功能的改变进而对机体造成损伤，因而亦具有较强的致癌、致畸、致突变的“三致”作用。此外，一些环境污染物分子可以直接与DNA发生作用并产生基因毒性，因此，研究污染物小分子与DNA的结合能力，可为判别污染物基因毒性、揭示污染物毒理、评价生态风险等提供重要参考依据。

结合常数K是反映小分子与DNA结合性能的直接、关键指标。但受限于DNA序列差异、三维结构差异、体内体外环境差异等因素，导致难以真实获取、测定小分子污染物与体内DNA作用的结合性能。此外，现有小分子与DNA结合性能及结合常数多采用荧光法分析，对于弱荧光或无荧光性质的分子则难以测定其结合常数。

因此，开展特异性识别DNA膜研究，在此基础上建立准确、可靠、灵敏的小分子-DNA结合常数K测定方法可以丰富、完善、补充现有小分子-DNA结合常数K测定方法具有重要意义。

发明内容

本发明公开了基于电化学技术的小分子-DNA结合常数计算方法，通过小分子与界面修饰的DNA发生作用，可使DNA膜层的电化学性能发生变化，从而实现结合能力及结合常数分析。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于电化学技术的小分子-DNA结合常数计算方法，包括如下步骤：

(1)制备DNA修饰电极：

将末端功能化的DNA制成溶液，涂于电极界面，交联孵育后清洗、吹干，得到DNA修饰电极；

(2)测定电化学信号：

测定DNA修饰电极的电化学信号S1；

取污染物小分子制成不同浓度溶液，将DNA修饰电极浸泡于污染物小分子溶液中进行孵育；孵育后DNA修饰电极清洗、吹干，测定电化学信号S2；

计算各浓度污染物小分子溶液孵育前后DNA修饰电极的电化学信号变化值Sw＝|S2-S1|；

(3)确定污染物小分子检测浓度：

根据电化学信号变化值最大值S_C，确定电化学信号变化值为S_CK的污染物小分子溶液浓度C_k为测定污染物小分子与DNA结合常数的检测浓度；S_CK/S_C＞0.70；

(4)构建标准曲线：

选择结合常数已知的不同污染物小分子，分别配置成浓度为C的溶液，按步骤(2)方法测定电化学信号，计算电化学信号变化值；根据结合常数与电化学信号变化值绘制标准曲线；

(5)测定结合常数：