[发明专利]牛昏睡嗜血杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针

权利要求书

1.一种用于对牛昏睡嗜血杆菌进行荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，其特征在于，

所述引物包括用于检测牛昏睡嗜血杆菌的上游引物Hs-F2和下游引物Hs-R2，其中所述上游引物Hs-F2包含如SED ID NO：4所示的核苷酸序列，所述下游引物Hs-R2包含如SEDIDNO：6所示的核苷酸序列；

所述TaqMan探针包括用于检测牛昏睡嗜血杆菌的探针Hs-P2，其包含如SED ID NO：5所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理；可选地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、MGB、DABCYL。

3.一种用于对牛昏睡嗜血杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，其中所述阳性对照品是含牛昏睡嗜血杆菌OmpA基因的重组质粒，所述阴性对照品为不含牛昏睡嗜血杆菌及其基因组DNA的组分，如DEPC处理水(双蒸水、去离子水等)。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品是含牛昏睡嗜血杆菌OmpA基因的重组质粒，其浓度选自1×10¹⁰、1×10⁹、1×10⁸、1×10⁷、和1×10⁶copies/μL。

6.一种用于对牛昏睡嗜血杆菌进行荧光定量PCR检测的非疾病诊断目的方法，其包括以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针的引导下进行荧光定量PCR检测；

(2)用步骤(1)得到的Ct值和出现的特异性扩增曲线对牛昏睡嗜血杆菌进行定性检测，和/或根据标准曲线和得到的Ct值，计算待测样品中所含牛昏睡嗜血杆菌核酸的拷贝数，实现定量检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其中步骤(2)中所述标准曲线的绘制方法包括以下操作：将牛昏睡嗜血杆菌标准品按照10倍梯度稀释至浓度1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²、1×10¹copies/μL，得到不同浓度的标准样品；以不同浓度的标准样品作为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针的引导下进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准样品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制得到标准曲线。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中步骤(1)中所述荧光定量PCR检测的体系包含荧光PCR预混液，其包含：Hieff Unicon Universal TaqMan multiplex qPCR master mix10-15μL、10μM的Hs-F2 0.25-1.0μL、10μM的Hs-R2 0.25-1.0μL、10μM的Hs-P2 0.4-1.0μL、模板4-10μL；和/或

步骤(1)中所述荧光定量PCR检测的条件为：95℃预变性5分钟；PCR扩增95℃变性15秒，56℃延伸30秒，45个循环。