[发明专利]牛昏睡嗜血杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针

说明书

本发明公开了一种牛昏睡嗜血杆菌的荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针，属于生物检测技术领域。提供的试剂盒包括用于检测牛昏睡嗜血杆菌的上游引物Hs‑F2和下游引物Hs‑R2，以及用于检测牛昏睡嗜血杆菌的探针Hs‑P2。利用该试剂盒及其专用引物和TaqMan探针，不仅可以用于对牛昏睡嗜血杆菌进行定性检测，还可以实现准确定量，且特异性强、灵敏度高，可以在牛昏睡嗜血杆菌的检测、疫情流行病学调查、疫病监测净化、菌种筛选、疫苗生产过程中的质量监控和稳产保供等方面发挥重要作用。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的动物疫病兽用检测，具体涉及一种用于牛昏睡嗜血杆菌的荧光定量PCR检测方法、检测试剂盒及其引物探针组。

背景技术

牛昏睡嗜血杆菌病是由牛昏睡嗜血杆菌(Haemophilus somnus，Hs)引起的，该菌为条件性致病菌，常与其他病原混合感染，引发牛呼吸道疾病综合征(BRDC)，常引起牛的肺炎、血栓栓塞性脑膜脑炎(TEME)，还引发败血症、关节炎、阴道炎和流产等。陈久兵等人(四川省某奶牛场犊牛呼吸道疾病的细菌性病原qPCR检测，浙江农业学报，2022，34(4):706-712)对2019-2020年75份有呼吸道疾病症状的犊牛鼻腔棉拭子和10份其他样品进行常见细菌性病原检测时，发现睡眠嗜血杆菌的检出率高达38.67％(29/75)，这一结果表明该病原菌可能是引起牛呼吸道疾病的常见病原，并已经大范围扩散，因此有必要对其开展流行性病学调查。

对睡眠嗜血杆菌进行准确、高灵敏度和高特异性检测是对该病原菌开展流行性病学调查的关键。John D.Loy等人(Development of a multiplex real-time PCR assayusing two thermocycling platforms for detection of major bacterial pathogensassociated with bovine respiratory disease complex from clinical samples，Journal of Veterinary Diagnostic Investigation1-11，2018，DOI:10.1177/1040638718800170，以下称文献1)公开一种用于检测牛昏睡嗜血杆菌的实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针，其对牛昏睡嗜血杆菌的检测限为1.2-12CFU/反应，具有较高的检测灵敏度，但该文献1在检测初期感染或隐性感染时的检出率仍表现不佳，因此有必要开发一种检测灵敏度更高的针对牛昏睡嗜血杆菌的实时荧光定量PCR引物和TaqMan探针。

发明内容

针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种用于对牛昏睡嗜血杆菌进行荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，其中，

所述引物包括用于检测牛昏睡嗜血杆菌的上游引物Hs-F2和下游引物Hs-R2，其中所述上游引物Hs-F2包含如SED ID NO：4所示的核苷酸序列，所述下游引物Hs-R2包含如SEDID NO：6所示的核苷酸序列；

所述TaqMan探针包括用于检测牛昏睡嗜血杆菌的探针Hs-P2，其包含如SED IDNO：5所示的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述TaqMan探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述TaqMan探针的3’端已经磷酸化处理；可选地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ(BHQ1、BHQ2、BHQ3)、MGB、DABCYL。

本发明另一方面提供一种用于对牛昏睡嗜血杆菌进行荧光定量PCR检测的试剂盒，其包括上述的引物和TaqMan探针。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，其中所述阳性对照品是含牛昏睡嗜血杆菌OmpA基因的重组质粒，所述阴性对照品为不含牛昏睡嗜血杆菌及其基因组DNA的组分，如DEPC处理水(双蒸水、去离子水等)。