[发明专利]一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法

权利要求书

1.一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法，其特征在于，所述检测方法至少包括以下步骤：

S1、分别配制底物溶液、Lys-C酶阳性对照品溶液、稀释液和待测样品溶液；所述底物为艾塞那肽；

S2、取所述Lys-C酶阳性对照品溶液、底物溶液和稀释液，按比例混合后，进行酶切反应，反应结束后终止反应，得到阳性对照品反应液；所述Lys-C酶阳性对照品溶液中的赖氨酰内切酶标准品和所述底物的质量比1：40000~ 55000；所述底物溶液的浓度为0.5 ~ 2mg/mL，所述Lys-C酶阳性对照品溶液中 Lys-C酶的浓度为0.2 ~ 1 μg/mL；

S3、取超纯水、所述底物溶液和所述待测样品溶液，混合后在与S2相同条件下进行酶切反应，反应结束后终止反应，得到待测样品反应液；

其中，超纯水的体积等于S2中所述Lys-C酶阳性对照品溶液的体积，所述待测样品溶液体积等于S2中所述稀释液的体积；S2和S3中底物溶液用量相同；所述待测样品溶液中胰岛素或其类似的浓度为10 ~ 30 mg/mL；

S4、对所述阳性对照品反应液和所述待测样品反应液分别进行高效液相色谱检测，比较酶切肽段的峰面积，判断所述待测样品中赖氨酰内切酶残留是否超过阳性对照品溶液的浓度；

所述高效液相色谱检测的条件为：

色谱柱选自C18反相色谱柱；

流动相：流动相A为0.1%TFA的水溶液，流动相B为含有0.1%TFA的乙腈；

流速：1.0 mL/min；

柱温：50℃；

检测波长：214 nm。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，S2、S3中，所述酶切反应的条件相同，均为35 ~ 40℃条件下反应5 ~ 15小时。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，S2中，所述Lys-C酶阳性对照品溶液中的赖氨酰内切酶标准品和所述底物的质量比1：50000。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，S2中，所述底物溶液的浓度为1mg/mL，所述Lys-C酶阳性对照品溶液中 Lys-C酶的浓度为0.5 μg/mL，

S3中，所述待测样品溶液中胰岛素或其类似的浓度为20 mg/mL。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，S2中，所述Lys-C酶阳性对照品溶液、所述底物溶液和所述稀释液的体积比为1：25：25；

S3中，所述超纯水、所述底物溶液和所述待测样品溶液的体积比为1：25：25。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S2中，所述Lys-C酶阳性对照品溶液、所述底物溶液和所述稀释液的体积分别为10 μL、250 μL和250 μL；

S3中，所述超纯水、所述底物溶液和所述待测样品溶液的体积分别为10 μL、250 μL和250 μL。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，S2和S3中均通过加入10 μL的1.5mol/L醋酸溶液终止反应。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述底物溶液和所述待测样品溶液均采用稀释液配制；所述稀释液为0.05 mol/L的Tirs-HCl缓冲液，pH为8.0。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述Lys-C酶阳性对照品溶液中 Lys-C酶的浓度为A，其在S2和S3中用量分别为V_a，所述待测样品中胰岛素或其类似物的浓度为B，其在S2和S3中用量分别为V_b，则在S4中，根据酶切肽段峰面积的比较，判断所述待测样品中Lys-C酶的含量是否超过检测限（A×V_a）/（B×V_b）。