[发明专利]一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法

说明书

本发明涉及生物检测技术领域，具体讲，涉及一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法。本发明的方法可以根据需要调整对照样品中Lys‑C酶浓度限度，进而简便、稳定且准确的判断待测样品中赖氨酰内切酶残留是否在限定范围内。本发明检测方法的灵敏度高、稳定性高，且简单、易于实施。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体讲，涉及一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法。

背景技术

赖氨酰特异性内切酶（Lysyl endopeptidase,EC3.4.21.50）又称赖氨酰肽链内切酶、无色杆菌蛋白酶I、赖氨酸内肽酶、赖氨酰内切酶、赖氨酸C端内切酶、Lys-C内切酶，是一种丝氨酸蛋白酶，最初由Masaki等人从土壤细菌中发现并分离得到的。赖氨酰肽链内切酶具有高度特异性，可特异性切割肽链中赖氨酸残基和S-氨乙基半胱氨酸残基羧基端的肽键。

根据重组人胰岛素、德谷胰岛素和门冬胰岛素氨基酸第29位为Lys的特点，充分利用Lys-C酶特异性高、成本低的优势，针对上述重组胰岛素和胰岛素类似物分别设计了包含Lys-C酶酶切位点的重组构建体。上述构建体在纯化后，经过Lys-C酶酶切等一系列反应，最终得到胰岛素或胰岛素类似物。因此，上述方法制备的胰岛素或胰岛素类似物中会有一定量的Lys-C酶残留，故需要对其残留浓度进行检测，确保Lys-C酶残留量控制在合理范围内。而经过纯化后的胰岛素或胰岛素类似物中，其Lys-C酶含量非常低。如何能够准确检测样品中Lys-C酶残留在指定的限度内，是亟需解决的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明通过大量的研究，提供了一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法，本发明的检测方法稳定可靠，灵敏度高，且方法简单、易于实施。

本发明的第一方面提出了一种胰岛素或其类似物中残留赖氨酰内切酶的检测方法，检测方法采用赖氨酰内切酶的底物分别与待测样品和阳性对照品进行酶切反应，通过比较两个酶切产物在高效液相色谱分析中的酶切肽段峰面积，判定待测品中残留赖氨酰内切酶的含量。

由于经过纯化的胰岛素或其类似物样品，其赖氨酰内切酶含量相对较低。而常规的赖氨酰内切酶底物Lys-PNA，是通过检测酶切底物吸光度确定酶活，而酶切后该酶切底物吸光度只有在一定酶浓度范围内，才能与酶活成比例，且灵敏度有限，其无法适用于低浓度条件的Lys-C酶残留量的检测。因此，本发明申请人经过广泛的筛选和深入的研究后发现，HGEGTFTSDLSKX尤为适合作为底物肽段，其经Lys-C酶切后得到的酶切肽段HGEGTFTSDLSK（简称“肽段H”），经高效液相在色谱波长214 nm分析检测，该肽段相较其他肽段紫外显著更强。而比较发现，该肽段即为艾塞那肽的起始肽段，因此，本发明申请人选择使用艾塞那肽作为底物使用。并基于该底物发现的进一步应用研究，本发明申请人研发得到了本发明的胰岛素或其类似物中残留Lys-C酶含量的检测方法。实验也表明，选用艾塞那肽作为底物的本发明的检测方法，当酶切比例为1：50000时，酶切肽段在214 nm仍有较强的吸收，且峰型良好、稳定，能稳定、准确的呈现检测结果。

艾塞那肽是一种新型糖尿病治疗药物，由美国礼来公司研发的降血糖素类似物，是肠促胰素类似物家族的第一个成员，经人工合成的多肽类化合物，其结构明确、稳定，且来源广泛。

具体的，本发明中的方法适用于所有的胰岛素或胰岛素类似物，包括但不限于重组人胰岛素、德谷胰岛素或门冬胰岛素等。

具体的，本发明的检测方法至少包括以下步骤：

S1、分别配制底物溶液、Lys-C酶阳性对照品溶液、稀释液和待测样品溶液；

S2、取Lys-C酶阳性对照品溶液、底物溶液和稀释液，按比例混合后，进行酶切反应，反应结束后终止反应，得到阳性对照品反应液；