[发明专利]一种皮肤组织来源外泌体的提取方法

权利要求书

1.一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于，该提取方法包括以下步骤：

皮肤组织预处理；

原代成纤维细胞提取；

细胞接种扩增；

所得细胞培养液过滤；

切向流超滤TFF设备纯化、浓缩。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：皮肤组织预处理时，无菌操作将样本组织放入加有2％青霉素、链霉素的PBS 10ml的细胞培养皿内进行清洗并去除血液和血管杂质，清洗5遍。

3.根据权利要求2所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：原代成纤维细胞提取时，细胞培养皿内固定展开皮肤，使用10ml分散酶II浸泡组织一定时间后，用无菌手术镊剥离表皮和真皮层，将表皮弃去，剩下的真皮层组织测量面积后进行切割成小块置于50ml离心管中，加入对应面积的消化试剂盒消化液进行过夜消化12-18小时；加入两倍体积的完全培养基终止消化。

4.根据权利要求3所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：原代成纤维细胞提取时，50ml离心管内所得组织悬液使用一个70μm细胞筛网进行过滤出细胞悬液，去除未消化组织；用5mL未预热的完全培养基清洗细胞筛网，收集细胞悬液于新的50mL离心管；50ml离心管在离心机上1000rpm，4℃，离心5min；用移液管吸取上清并弃去所得到的分离后细胞。

5.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：细胞接种扩增时，上述所的细胞加入5ml完全培养基重悬，细胞计数后根据细胞数量加入一定量的完全培养基混匀后加入若干个T25培养瓶内接种培养，将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃，5％CO2条件培养。

6.根据权利要求5所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：细胞接种扩增时，细胞融合度达到80％以上则进行传代操作：按T75培养瓶计，吸出旧培养基，加入5mlPBS缓冲液洗涤吸去，添加0.25％含EDTA胰酶3mL，T25瓶为1ml，消化2-4min，加入2倍以上胰酶体积的完全培养基终止消化，将细胞冲洗下来，细胞悬液吸出至50ml离心管；200g/min离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬细胞，取100μL悬液计数，根据细胞计数用完全培养基稀释后接种至若干个T75培养瓶，接种浓度(1.5-2.0)*10^6个/瓶，37℃培养箱静置培养。

7.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：所得细胞培养液过滤时，组装一次性过滤瓶，滤膜为0.8μm孔径，收集瓶可根据收集上清液的量更换为适合大小的一次性无菌瓶或灭菌玻璃瓶，过滤瓶连接抽吸装置管路。

8.根据权利要求6所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：所得细胞培养液过滤时，打开过滤瓶盖子，吸取离心管内收集的上清液加入过滤瓶上层进液端；吸取10mL PBS溶液对离心管进行润洗后，再加入过滤瓶上层进液端；检查管路连接正常，过滤瓶盖子旋紧后，开启抽吸装置，开始过滤；待进液端液体抽干后，吸取10mlPBS溶液清洗滤膜，可适当增加清洗步骤直到进液端无气泡残留；进液端液体抽干后，断开管路，关闭抽吸装置，取下收集瓶，盖上收集瓶盖子放入4℃冷藏箱暂存。

9.根据权利要求1所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：向流超滤TFF设备纯化、浓缩时，试剂准备：无菌水、1％NAOH溶液、1*PBS溶液、0.1％磷酸溶液、0.5％清洁剂、75％乙醇，以上溶液都经0.22μm滤膜过滤，4℃冰盒准备；TFF预设管路套装连接，整体灭菌套装连接设备；打开TFF软件，选择“自动模式”，按照预设程序进行操作；PBS溶液润洗10min后停止，中空纤维柱及管路完成润洗。

10.根据权利要求9所述的一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，其特征在于：向流超滤TFF设备纯化、浓缩时，准备好PBS溶液装于50mL离心管内，将原液端管路放入PBS溶液中，点击开始运行，注意观察离心管上刻度，吸取10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；再次将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，同样吸取10mLPBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，吸取回流液循环5次左右；最后将原液端管路放入离心管中PBS溶液中，吸取5-10mL PBS溶液后，将管路立即移出放入原液瓶，待回流干净后即可停止系统，取得的回流液即为最终的EV浓缩液。