[发明专利]一种皮肤组织来源外泌体的提取方法

说明书

本发明涉及纤维细胞分离技术领域，具体为一种皮肤组织来源外泌体的提取方法包括以下步骤：皮肤组织预处理；原代成纤维细胞提取；细胞接种扩增；所得细胞培养液过滤；切向流超滤TFF设备纯化、浓缩；有益效果为：本发明提出的皮肤组织来源外泌体的提取方法从真皮层中提取成纤维细胞，能增加提取细胞的纯度和活性，在细胞增值能力上相对全皮提取的细胞大大提升，更容易扩增和产生更多的外泌体产量；初过滤有效减少了大的杂质，然后使用切向流超滤(TFF)设备，过程可控、操作简便，所得外泌体纯度、产量较高。

技术领域

本发明涉及纤维细胞分离技术领域，具体为一种皮肤组织来源外泌体的提取方法。

背景技术

外泌体是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，因其携带复杂的生物信息，如信使RNA(mRNA)、微小核醣核酸(microRNAs)等，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。人体几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体，外泌体广泛存在并分布于血清、血浆、唾液、尿液、脑脊液和乳液等多种体液中。

现有技术中，外泌体在医疗领域有着巨大应用前景，可以协助疾病的诊断和治疗，随着科技的发展，外泌体也在越来越多的疾病领域得到运用。在皮肤疾病领域，外泌体可以加速I型胶原和III型胶原的基因表达，促进成纤维细胞增殖、胶原合成；可以帮助促进血管生成；可以帮助伤口愈合、抑制瘢痕形成、调节免疫反应等。在临床上，外泌体可以用于治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡，再生健康皮肤；在护肤方面，外泌体可以修复受损肌肤，从而全面改善肤质，让肌肤回到健康、年轻的状态。

但是，用于皮肤治疗的外泌体主要来源于人皮肤组织提取的细胞上清液中，其中以成纤维细胞较为常见。传统的成纤维细胞提取方法是使用全皮的消化试剂盒对整块组织进行消化配合物理剪切的方式提取成纤维细胞，此方法缺点是：(1)杂细胞种类、数量较多，难以获得纯度、活性较高的成纤维细胞；(2)使用此细胞扩增后从上清液中提取的外泌体有所差别。在对接下去上清液中的外泌体提纯过程中，传统的方法是使用超滤管进行浓缩，此方法的缺点是：(1)超滤管有产生漏液的风险而无法截留到足够多的外泌体；(2)产量很低，仅能用于科研；(3)配合离心机使用，外泌体所受离心力无法控制，容易破裂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种皮肤组织来源外泌体的提取方法，该提取方法包括以下步骤：

皮肤组织预处理；

原代成纤维细胞提取；

细胞接种扩增；

所得细胞培养液过滤；

切向流超滤TFF设备纯化、浓缩。

优选的，皮肤组织预处理时，无菌操作将样本组织放入加有2％青霉素、链霉素的PBS 10ml的细胞培养皿内进行清洗并去除血液和血管杂质，清洗5遍。

优选的，原代成纤维细胞提取时，细胞培养皿内固定展开皮肤，使用10ml分散酶II浸泡组织一定时间后，用无菌手术镊剥离表皮和真皮层，将表皮弃去，剩下的真皮层组织测量面积后进行切割成小块置于50ml离心管中，加入对应面积的消化试剂盒消化液进行过夜消化12-18小时；加入两倍体积的完全培养基终止消化。

优选的，原代成纤维细胞提取时，50ml离心管内所得组织悬液使用一个70μm细胞筛网进行过滤出细胞悬液，去除未消化组织；用5mL未预热的完全培养基清洗细胞筛网，收集细胞悬液于新的50mL离心管；50ml离心管在离心机上1000rpm，4℃，离心5min；用移液管吸取上清并弃去所得到的分离后细胞。

优选的，细胞接种扩增时，上述所的细胞加入5ml完全培养基重悬，细胞计数后根据细胞数量加入一定量的完全培养基混匀后加入若干个T25培养瓶内接种培养，将培养瓶放入CO2培养箱中，37℃，5％ CO2条件培养。