[发明专利]一种用于检测HER2拷贝数变异的引物探针、数字PCR试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测HER2拷贝数变异的引物探针、数字PCR试剂盒及检测方法，包含序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的HER2基因检测引物对和序列如SEQ ID NO:3所示的MGB探针，序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的内参基因EFTUD2检测引物对和序列如SEQ ID NO:6所示的内参基因MGB探针。本发明仅通过一组HER2引物以及内参基因引物探针就能达到精准判读HER2拷贝数是否发生变异，具有简便易行，高灵敏度和稳定性、可重复的特点。

技术领域

本发明涉及生物医学核酸检测技术领域，特别是肿瘤靶向治疗相关的基因检测技术领域，具体地说，涉及一种用于检测HER2拷贝数变异的引物探针、芯片式数字PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

HER2基因(人类表皮生长因子受体-2，Human Epidermal Growth FactorReceptor-2)定位于染色体17q21，编码分子量为185kDa的跨膜受体样蛋白(HER2蛋白)，具有胞内跨膜酪氨酸激酶活性。在人体中HER2基因扩增引起HER2蛋白受体的过表达会促进细胞的生长和增殖，从而导致肿瘤发生，同时也会抑制细胞的凋亡致化疗耐药，诱导血管新生，提高细胞运动能力增强肿瘤的浸润转移作用。因此HER2是肿瘤免疫治疗研究中的一个重要靶分子。有研究表明，在乳腺癌和胃癌中，HER2基因的阳性扩增比率分别为15～20％和10％～30％，在乳腺癌患者中，HER2阳性扩增的患者，恶化程度迅速，更易复发，预后较差，生存时间短。因此，特异的靶点药物通过抑制HER2扩增，可延长HER2乳腺癌患者的存活率和改善转移性或复发胃癌患者的病发程度。

免疫组织化学法(IHC)检测HER2蛋白表达是目前最为常用的方法，它是用带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术，IHC法因其操作简便、价格低廉、判读方便、便于保存等优点，已广泛应用于临床病理诊断，但由于其检测过程缺乏标准化，且结果易受组织处理、不同抗体的敏感性差异、观察者主观判断的不同以及17号染色体多体的干扰的影响，常造成其检测结果的差异。

相对而言，荧光原位杂交法(FISH)通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，利用荧光检测体系对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析，其检测冷冻组织或福尔马林固定、石蜡包埋组织的HER2基因扩增的稳定性较好，不易受组织处理等影响，且应用不同颜色的荧光信号同时标记HER2基因和17号染色体着丝粒，消除了17号染色体多体的干扰，然而FISH也存在检测费用昂贵、荧光淬灭致结果无法长期保存、操作难度大，时间长、并且不利于病理医生在暗视野下观察组织细胞形态等缺点，从而导致HER2假阳性或假阴性的误判等缺陷。

在当今PCR技术高速发展的时代，芯片式数字PCR(chip digital PCR，cdPCR)作为第三代PCR技术，是一种基于高通量的PCR技术，相较初代以及二代PCR，有极高的准确性，可以对较低浓度的样本进行特异性检出，同时基于高通量的的特点，做到对核酸浓度的绝对定量。

因此，可以开发相关利用数字PCR技术对HER2基因扩增检测，提高对HER2表达状态的准确检测，更加准确的判断HER2基因是否发生拷贝数变异。

发明内容

为了解决现有的HER2拷贝数变异检测方法较繁复，且实验结果难以复现，检测结果出现假阳性和假阴性的问题，本发明目的是提供一种用于检测HER2拷贝数变异的特异性引物探针，从而实现对HER2表达状态的准确检测，并在很大程度上避免假阳性和假阴性的检测结果，从而更加准确的判断HER2基因是否发生拷贝数变异。

本发明的另一目的是提供一种用于检测HER2拷贝数变异的数字PCR试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种基于dPCR的HER2拷贝数变异的检测方法。

本发明的还一目的是提供一种所述特异性引物探针在制备用于检测HER2拷贝数变异的试剂盒中的应用。