[发明专利]一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于，包括：

S1、提供CRISPR反应体系和封闭序列，配置成预混反应液；

其中所述CRISPR反应体系包括Cas效应蛋白、crRNA或sgRNA、荧光报告探针、封闭序列和反应缓冲液；

所述封闭序列是至少具有光致断裂基团以及硫代磷酸两种修饰的核苷酸序列或核苷酸类似物，其用于与CRISPR反应体系中的Cas效应蛋白形成蛋白核酸复合物而使其酶活性沉默，且所述光致断裂基团具有光照断键特性，其在经光激发后断裂，以使所述封闭序列与Cas效应蛋白分离而使Cas效应蛋白的酶活性去沉默；

S2、将包含目标核酸的待测物与上述预混反应液混合得到混合体系，随即将该混合体系分散至大量体积均一的微反应单元；

S3、启动UV光照，并提供适宜的温度条件孵育微反应单元；

所述光致断裂基团经光激发后断裂，以使所述封闭序列与Cas效应蛋白分离，Cas效应蛋白的酶活性去沉默，所有微反应单元中crRNA或sgRNA在同一时间点启动识别目标核酸序列并触发Cas效应蛋白启动协同效应持续切割荧光报告探针；

S4、完成孵育反应后读取微反应单元中的荧光信号，设定判定阴性/阳性信号的强度阈值，计算待测样品中目标核酸的含量。

2.根据权利要求1所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：所述封闭序列为单碱基重复序列或随机碱基序列，其长度为5～200nt。

3.根据权利要求1所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：所述光致裂解基团为嵌入修饰于所述封闭序列内。

4.根据权利要求3所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：所述封闭序列中光致裂解基团的修饰个数为3～199个，其中每隔1～50个碱基嵌入修饰一个光致裂解基团；所述封闭序列中硫代磷酸的修饰位点个数为4～199个。

5.根据权利要求3所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：所述光致裂解基团为PC-Linker。

6.根据权利要求1所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：所述封闭序列为单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、DNA和RNA形成的杂合双链或DNA和RNA形成的嵌合链。

7.根据权利要求1所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：步骤S1所述CRISPR反应体系中封闭序列与Cas效应蛋白的摩尔浓度比为0.01～100：1。

8.根据权利要求1所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：步骤S2中将所述混合体系分散到大量体积均一的微反应单元的方式包括微腔室阵列方式和微液滴乳化方式；

步骤S4中包括统计阳性微反应单元总数或阳性微反应单元数目所占的统计微反应单元总数的比例，计数得到待测样品中包含目标核酸分子的数量，或利用泊松分布原理测算得到待测标本中目标核酸分子的原始浓度。

9.根据权利要求1所述的光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其特征在于：

步骤S2中，Cas效应蛋白在混合体系中的终浓度为10～200nM，crRNA/sgRNA在混合体系中的终浓度为20～400nM，荧光报告探针在混合体系中的终浓度为200～2000nM，在混合体系中封闭序列的终浓度与Cas效应蛋白的终浓度之比为0.01～100：1；

步骤S3中UV光照的时长为5s～30min，所用UV光的波长为300～400nm，功率为10～300W。

10.一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1～9任一项所述的预混反应液。