[发明专利]一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种光调控的单分子CRISPR‑Cas检测方法及试剂盒。所述检测方法包括：S1、提供CRISPR反应体系和封闭序列，配置成预混反应液；S2、将包含目标核酸的待测物与预混反应液混合得到混合体系，并将该混合体系分散至大量体积均一的微反应单元；S3、UV光照，并孵育微反应单元；S4、读取荧光信号，计算目标核酸的含量。封闭序列能够与CRISPR反应体系中的Cas效应蛋白稳定结合以沉默该蛋白活性，且封闭序列中的光致断裂基团在光照后断键，并与Cas效应蛋白分离，而使其活性去沉默，这种光调控的方式能够使每个微反应单元中的CRISPR催化体系在同一时刻启动，避免了在微反应单元分配完成前少量Cas蛋白被激活降解待测靶标和报告探针从而引起的背景信号升高和定量不精确的问题。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法及试剂盒。

背景技术

定量检测核酸分子不管是在科研还是医疗领域均具有重要的应用价值，例如microRNA表达水平的绝对定量、无创产前筛查、稀有突变频率分析、拷贝数变异(CNV)分析、基因编辑效率评估等方面均需要高效地利用低丰度有限量的样品进行精准的定量检测。目前作为核酸定量金标准的定量PCR(qPCR)技术，以及第三代的微液滴数字PCR(Dropletdigital polymerase chain reaction,dd PCR)技术，均有高的检测灵敏度和定量能力，但其过程涉及的逆转录和核酸扩增等步骤易受多种因素干扰而影响检测的准确性。免核酸扩增的直接对目标DNA/RNA分子进行检测的方法不仅可以从根本上避免常规扩增方法可能引起的气溶胶污染风险，还避免了由于扩增偏差和转录不充分引起的不精确性。近年来发展的例如单分子荧光光谱、纳米孔、纳米原子力显微镜、DNA纳米技术等方法可以在单分子水平上进行核酸检测，但以上传感方法都依赖于分子扩散，所以需要样品具有较高浓度才能实现，无法检测低丰度的有限量的样品，在一定程度上限制了其广泛应用。

CRISPR-Cas系统源自细菌和古细菌的适应性免疫系统，由于其具有的可编程、高特异和恒温反应等特性，近年来诸多基于CRISPR-Cas进行病原体检测、肿瘤诊断以及现场检测的核酸技术相继出现。由于CRISPR-Cas蛋白具有极其高效的反式切割活性，即在被靶标核酸分子激活后可以非特异性地切割成千上万个报告分子，从而达到较高的信号放大效果。基于CRISPR-Cas系统的这一高效的反式切割信号放大特性，开发了一种超局域的CRISPR-Cas反应系统，实现了单分子灵敏度的免核酸扩增的核酸绝对定量。特别是，这一免扩增直接检测方式的灵敏度还可以进一步通过采用多个crRNA组合靶向同一靶标的不同位点的方式进行改善。

由于CRISPR催化反应在较低温度下依然有残余活性，因此在体系配制和微反应单元的分配过程中，待测靶标和探针有可能会被部分提前激活的Cas蛋白降解，造成不同微反应单元的反应起点不一致、背景信号升高等问题，从而影响后续定量的精确性。尤其在利用多个crRNA组合的方式时，虽然可以提高检测的灵敏度，但未封闭活性的Cas蛋白会在不同crRNA的靶向位点切断长链靶标，靶标片段会随着微反应单元的分配分散到不同的微反应单元中造成阳性单元数量比实际偏高的情况，无法得到精准的定量信息。为了达到真正高精度的定量检测，尤其在面临需要精确到单个分子以及分辨微弱的碱基差异和原初浓度信息的检测时，需要对该反应进行精准调控：即在反应体系配制和微反应单元发生过程中暂时“关闭”Cas蛋白的活性，一旦微反应单元分配完成之后，利用简单便捷、不影响反应、通用的方式“复苏”蛋白，使得各个微反应单元的单分子反应可以在同一时间“起跑”。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其具有精准度高、免扩增以及灵敏度高的优点。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种光调控的单分子CRISPR-Cas检测方法，其包括：

S1、提供CRISPR反应体系和封闭序列，配置成预混反应液；