[发明专利]响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺

权利要求书

1.一种响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取摇瓶培养阶段的菌液，稀释后置于离心机内离心，弃上清待用；

(2)基于预实验结果，得出影响毕赤酵母胞内蛋白提取含量的因素为玻璃珠用量、发酵液体积以及破碎时间，根据单因素多水平实验，筛选出玻璃珠用量、发酵液体积以及破碎时间的参数范围；

(3)根据步骤(2)中单因素多水平实验筛选出的各参数范围，对玻璃珠用量、发酵液体积以及破碎时间每三个影响因素分别选取-1，0，1，低、中、高三个水平，以胞内蛋白含量为响应值设计三因素三水平试验表；

(4)对步骤(3)中的实验数据进行多元线性回归和二项拟合并建立回归方程，得到以胞内蛋白含量为响应值的响应曲面图；通过对试验结果分析，得到毕赤酵母胞内蛋白最佳提取工艺参数为：玻璃珠用量1.0g，发酵液体积0.5mL，破碎时间250s。

2.根据权利要求1所述的一种响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺，其特征在于，步骤(4)中所述回归方程如下：Y＝289.64+1.52A–11.15B+6.75C+7.06AB+0.44AC+2.56BC–10.84A²–8.49B²–9.08C²，其中：Y表示胞内蛋白含量，A为玻璃珠用量(g)，B为发酵液体积(mL)，C为破碎时间(s)。

3.根据权利要求1所述的一种响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺，其特征在于，步骤(2)所述单因素多水平实验的方法步骤具体如下：

(a)玻璃珠用量对毕赤酵母蛋白提取的影响

取摇瓶培养阶段的菌液，将菌液的OD值稀释至30，分别取1ml稀释后的发酵液于EP管中，置于离心机内12000rpm条件下离心后弃上清，加入等体积的毕赤酵母缓冲液，每个EP管中加入直径为0.5mm的酸洗玻璃珠，玻璃珠用量分别取0.4g、0.6g、0.8g、1.0g、1.2g，每个点设置3个平行实验；将全自动样品冷冻研磨仪预冷至-4℃，将样品放置仪器中，设置时间为240s，功率为65Hz；破碎后的样品置于离心机内12000rpm条件下离心后取上清，将上清液用去离子水稀释至BCA标曲范围内，分别取20μL的上清液与200μL的BCA工作液于96孔板内混合，放置于酶标仪内562nm处测量OD值，计算每个点的蛋白质浓度，绘制曲线，标明误差线；

(b)发酵液体积对毕赤酵母蛋白提取的影响

实验操作步骤同(a)，将菌液的OD值稀释至30，玻璃珠用量为1.0g，菌液体积分别取0.5ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，离心后加入等体积的毕赤酵母缓冲液，破碎时间为240s，破碎功率为65Hz，重复上述实验；

(c)破碎时间对毕赤酵母蛋白提取的影响

实验操作步骤同(a)，将菌液的OD值稀释至30，玻璃珠用量为1.0g，菌液体积为0.5ml，离心后加入等体积的毕赤酵母缓冲液，破碎时间分别取60s、120s、180s、240s、300s、360s，破碎功率为65Hz，重复上述实验。