[发明专利]响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺

说明书

本发明提供响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺，通过玻璃珠破碎法提取毕赤酵母胞内蛋白，采用响应面法优化蛋白提取工艺，研究玻璃珠用量，发酵液体积以及破碎时间对毕赤酵母胞内蛋白提取浓度的影响。基于单因素实验的结果，设计三因素三水平的正交试验，建立三因素对毕赤酵母胞内蛋白提取浓度的二次多项式回归模型，以期获取最佳胞内蛋白提取工艺。实验结果表明，毕赤酵母胞内蛋白最佳提取工艺为玻璃珠用量1.0g，发酵液体积0.5mL，破碎时间250s时，胞内蛋白提取浓度为294.52mg/gDCW，相较于传统的玻璃珠破碎法提高了17.9％。

技术领域

本发明涉及蛋白提取技术领域，尤其涉及响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺。

背景技术

随着生物工程技术的发展，通过DNA技术构建重组酵母菌株可表达所需的蛋白质。酵母细胞作为模式生物具有重要的研究意义，人们对于酵母提取物的需求呈现逐步上升趋势。酵母菌的细胞壁呈现坚韧的“三明治”结构，为了有效利用酵母胞内营养物质，需对酵母细胞进行破壁处理。目前常用的细胞破壁技术分为机械破壁和非机械破壁。机械破壁中常用的方法包括玻璃珠破碎法、超声破碎法、高压均质破碎法等，非机械破壁中常用的方法包括反复冻融法、酶法等，每种方法都有其优缺点。玻璃珠破碎法的仪器设备较为成熟，操作过程中可以将温度控制在合理范围内，但由于操作过程中玻璃珠与容器壁之间的机械摩擦，易对生物产物的活性产生影响。

毕赤酵母表达系统具有稳定表达、低成本高水平生产以及遗传操作简便等多种优势，能够分泌具有天然构象结构和强免疫原性的异源蛋白，毕赤酵母已成为产重组亚单位疫苗的重要宿主系统，毕赤酵母是表达膜蛋白和小分子生物活性肽、抗菌肽的新型宿主。目前对毕赤酵母胞内蛋白提取工艺的研究较少，未见响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种采用响应面法优化玻璃珠破碎毕赤酵母提取胞内蛋白工艺，通过二喹啉甲酸法(BCA)测定胞内总蛋白浓度，获取最佳操作工艺，大大缩短了蛋白提取时间，并且提高了蛋白提取浓度。

为了实现上述目的，本发明提供了一种响应面法优化毕赤酵母胞内蛋白提取工艺，包括以下步骤：

(1)取摇瓶培养阶段的菌液，稀释后置于离心机内离心，弃上清待用；

(2)基于预实验结果，得出影响毕赤酵母胞内蛋白提取含量的因素为玻璃珠用量、发酵液体积以及破碎时间，根据单因素多水平实验，筛选出玻璃珠用量、发酵液体积以及破碎时间的参数范围；

(3)根据步骤(2)中单因素多水平实验筛选出的各参数范围，对玻璃珠用量、发酵液体积以及破碎时间每三个影响因素分别选取-1，0，1，低、中、高三个水平，以胞内蛋白含量为响应值设计三因素三水平试验表；

(4)对步骤(3)中的实验数据进行多元线性回归和二项拟合并建立回归方程，得到以胞内蛋白含量为响应值的响应曲面图；通过对试验结果分析，得到毕赤酵母胞内蛋白最佳提取工艺参数为：玻璃珠用量1.0g，发酵液体积0.5mL，破碎时间250s。

在本发明的一优选实施方式中，步骤(4)中所述回归方程如下：Y＝289.64+1.52A–11.15B+6.75C+7.06AB+0.44AC+2.56BC–10.84A²-8.49B²–9.08C²，其中：Y表示胞内蛋白含量，A为玻璃珠用量(g)，B为发酵液体积(mL)，C为破碎时间(s)。

在本发明的一优选实施方式中，步骤(2)所述单因素多水平实验的方法步骤具体如下：

(a)玻璃珠用量对毕赤酵母蛋白提取的影响