[发明专利]显微术中进行三维成像的方法、装置和显微镜

说明书

本发明涉及用于显微术中的三维成像的方法，其中借助于校正元件在检测光路中校正来自样本的检测辐射的像差；以空间分辨的形式捕获校正的检测辐射。该方法的特征在于，确定校正元件的最佳可能校正设置，通过最佳可能校正设置，在最佳可能校正设置时出现的像差得以尽量减少；并且基于最佳可能校正设置，确定缺陷校正设置，在缺陷校正设置下出现的像差导致检测辐射的不对称点扩散函数。确定在缺陷校正设置下出现的不对称PSF，并且引发所确定的缺陷校正设置。二维地获取样本的图像数据，并且基于不对称PSF的不对称性的相应被捕获的显现，在不同情况下将检测光路的光轴方向上的位置至少分配给选定的图像数据。本发明还涉及用于显微术的装置和显微镜。

技术领域

本发明涉及使用不对称点扩散函数(PSF)在显微术中进行三维成像的方法。本发明还涉及用于实施该方法的装置和显微镜。

背景技术

在显微技术领域，特别是当使用生物样本的标记结构和分子(物体)成像时，需要高图像分辨率，同时需要对样本和待成像的物体具有低水平的应力。如果图像数据的捕获(图像记录)发生在很长的照明时段内和/或发生多次，最小化样本上的应力是特别有利的。例如，当要检测和捕获(追踪)一个或多个物体在特定时段内的位置变化时，使用这种照明方案。

从现有技术中已知，用光片来照明样本在本质上仅激发了薄的照明平面中的标记物体，用于发射检测辐射(参见例如DE 10 2016 212 020 A1)。借助于照明辐射而激发的该物体在照明平面内的位置可以借助于空间分辨(二维)检测器(相机)来确定，并且以这种方式可以二维地定位各个检测辐射的来源。

为了获得关于检测光路的光轴方向(Zc方向；3D)上的原点位置的二维(2D)定位信息，可以以这样的方式修改点扩散函数，即：使得点光源的成像的旋转位置和/或轮廓形状可以用于推断点光源的Zc位置。

例如，可以从检测物镜的焦点位置偏移地辐射光片，并且分析点光源的成像的轮廓形状，以便确定所捕获的点光源的Zc位置(DE 10 2013 208 926 A1)。

也有可能借助于相应设计的掩模(双螺旋法)将PSF形成为双螺旋，使得点光源被成像为两个独立的光点。这些点相对于彼此的相对旋转位置允许确定相关的Zc位置(WO2021/039636 A2；帕瓦尼(Pavani)等，2009：“利用双螺旋点扩散函数的超越衍射极限的三维单分子荧光成像(Three-dimensional，single-molecule fluorescence imagingbeyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function)”；PNAS 106：29954-2999)。

根据现有技术的解决方案的缺点是生成双螺旋PSF所需的昂贵的掩模，以及根据DE 102013208926A1的解决方案可应用的光学装置的非常有限的范围，其中，特别地，检测光路的光轴倾斜地穿过具有不同折射能力的单独的层，例如使用倒置显微镜时就是这种情况。

发明内容

本发明基于提出一种方法的目的，利用该方法减少了现有技术的缺点，并且使得具有高分辨率的三维成像成为可能。本发明的目的还在于提出一种合适的装置，特别是光学装置和具有这种装置的显微镜，可以借助于该装置执行该方法。

该目的通过独立和备选独立权利要求的主题来实现。从属权利要求的主题是有利的发展。