[发明专利]一种细胞外囊泡富集材料及其制备方法和应用

说明书

本发明属于细胞外囊泡富集材料领域，具体涉及一种细胞外囊泡富集材料及其制备方法和应用。在胺化聚丙烯酸微球材料基础上进行苯硼酸功能化修饰，即可制备得到苯硼酸修饰后的聚丙烯酸微球材料，再通过与DSPE‑PEG‑多巴胺在中性条件下通过苯硼酸‑邻二羟基的络合作用，即制备完成。该制备方法快速便捷、安全无毒，制备的DSPE修饰后的聚丙烯酸微球材料能够从细胞培液中高效快速地富集EVs，并且改变环境的pH，实现EVs的无损释放，用于进行下游的生物功能分析。同时可以结合分子生物学实验等技术对EVs内蛋白质或核酸进行提取和分析，这为EVs的下游功能分析提供可靠的方法，有利于生物样品中EVs的生物学功能的深入研究。

技术领域

本发明属于细胞外囊泡富集材料领域，具体涉及一种细胞外囊泡富集材料及其制备方法和应用。

背景技术

硼酸与顺式邻二羟基分子之间具有选择性识别作用，当顺势邻二羟基物质所处的pH环境较高时(一般大于7)，硼酸配基化合物中的硼原子会和所处环境中的氢氧根发生络合作用，从而使硼原子的杂化状态由原来平面型的sp²状态转化为四面体的sp³状态，此时转化后的四面体型的硼酸化负离子就可以和顺式邻二羟基物质中相邻的两个羟基发生共价反应从而生成五元环或六元环的环状酯。但当所处环境的pH变为酸性时，硼酸配基化合物中的硼原子又会从四面体的sp³状态转变为原来的平面型的sp²杂化状态。这样就能促使生成的五元环或者六元环的环状酯可以顺利发生解离，释放出顺式邻二羟基分子。因此，可以通过改变环境的pH值用于控制硼酸-邻二羟基的结合。

细胞外囊泡(EVs)由不同种类的细胞(如肿瘤细胞、免疫细胞)分泌，其尺寸在30-1000nm，并且携带生物信息分子(如蛋白质、核酸、脂质体等)参与细胞间的信息交流。EVs与肿瘤的大小、淋巴结转移数量以及肿瘤细胞的类型密切相关。因此，肿瘤细胞来源的EVs是一种理想的肿瘤早期诊断的标志物，在肿瘤液体活检中受到了广泛关注。目前，从生物样本中分离出小细胞外囊泡大多基于超速离心法、免疫亲和、聚合物共沉淀、尺寸排阻及微流控等原理的提取方法。但是，以上方法都有不可避免的局限性，如耗时低效、步骤繁琐、纯度低以及易造成EVs的物理性结构损伤等。基于材料的捕获方法可以快速高效地捕获生物样本中的EVs，因此受到了越来越多的关注。二硬酯酰基磷脂乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)是一类PEG化磷脂，具有良好的生物相容性，常被用作纳米制剂载体材料。而DSPE分子具有亲脂性的脂肪酸尾，与细胞或EVs的磷脂膜具有较强的作用力，可被作为脂探针，用于体液中EVs的分离，将其通过化学反应键合到材料基质上，可以实现对EVs的高效富集。

发明内容

现有技术中存在的技术问题是具有不可避免的局限性，如耗时低效、步骤繁琐、纯度低以及易造成EVs的物理性结构损伤等。需要找到合适的替代方案来提高效果。

为了进一步提高聚合物材料对细胞外囊泡(EVs)的富集能力，改进材料的特性，本发明提供一种细胞外囊泡富集材料的制备方法(DSPE通过苯硼酸与邻二羟基的作用与聚丙烯酸微球相连)，包括如下步骤：

S11：制备DSPE-PEG-多巴胺和苯硼酸修饰聚丙烯酸微球；所述DSPE-PEG-多巴胺由反应性DSPE-PEG和多巴胺反应得到；所述苯硼酸修饰聚丙烯酸微球由胺化聚丙烯酸微球、对醛基苯硼酸和腈基硼氢化钠反应得到；

所述胺化聚丙烯酸微球购买自西安蓝晓科新材料股份有限公司。

S12：将所述DSPE-PEG-多巴胺、苯硼酸修饰聚丙烯酸微球、乙醇水溶液、Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和碳二亚胺(EDC)混合后反应，得到所述细胞外囊泡富集材料。