[发明专利]一种诱导性多能干细胞制备通用血小板的方法

权利要求书

1.一种诱导性多能干细胞制备通用血小板的方法，其特征在于：所述方法包括制备低免疫原性诱导性多能干细胞、诱导生成造血内皮细胞、诱导生成巨核细胞谱系特异性祖细胞、诱导生成前血小板形成细胞、收集血小板；

所述制备低免疫原性诱导性多能干细胞为将诱导性多能干细胞的β2微球蛋白敲除，获得β2微球蛋白缺陷型诱导性多能干细胞，即低免疫原性诱导性多能干细胞；

所述诱导生成造血内皮细胞，将低免疫原性诱导性多能干细胞，用无饲养层诱导性多能干细胞培养基mTeSR1重新悬浮，控制细胞密度为10⁵/mL，得到细胞悬浮液；将细胞悬浮液接种在含胶原蛋白IV的涂层容器中，添加终浓度为10μM的小分子 ROCK 抑制剂 Y27632，置于37℃、5%CO₂培养箱中贴壁培养，24小时后，去除含Y27632分子的mTeSR1培养基，添加等量的分化起始培养基DIM进行诱导分化；

所述诱导分化的具体方法为:

将添加含有因子的分化起始培养基DIM后的培养物转移到5%O₂、37℃、5%CO₂环境中静置2天，第3天，更换新鲜的含有因子的分化起始培养基DIM，并将培养物放回到5%O₂、37℃、5%CO₂环境再持续2天；第5天，再次更换新鲜的含有因子的分化起始培养基DIM，并将培养物置于常氧培养条件、37℃、5%CO₂下继续培养2天，得到造血内皮细胞；

所述含有因子的分化起始培养基DIM，为分化起始培养基DIM中添加终浓度为50ng/mL的骨形态发生蛋白-4、50ng/mL的血管内皮生长因子、50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子；

所述分化起始培养基DIM的配置方法为：IMDM作为基础培养基，添加终浓度为100μg/mL的人血清白蛋白，5μg/mL的铁饱和转铁蛋白，10μg/mL的胰岛素，2mg/mL的β-巯基乙醇，30μg/mL的可溶性低密度脂蛋白，5μg/mL的胆固醇；

所述诱导生成巨核细胞谱系特异性祖细胞，将造血内皮细胞的培养基，更换成含有因子的MLP 衍生和扩展培养基，控制细胞密度为10⁵/mL，将细胞在37℃和5%CO₂下培养7天，得到巨核细胞谱系特异性祖细胞；

所述含有因子的MLP 衍生和扩展培养基为MLP-DEM中添加终浓度25ng/mL的干细胞因子、25ng/mL的血小板生成素、25ng/mL的Fms-相关酪氨酸激酶3配体、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的白细胞介素3和5 Units/mL的肝素；

所述MLP-DEM的配置方法为：50%(v/v)IMDM培养基、30%(v/v)F-12培养基和18% (v/v)无蛋白杂交瘤细胞培养基混合，添加终浓度为100μg/mL的rh白蛋白，0.05wt%的聚乙烯醇，0.25μM的亚油酸，5μg/mL的合成胆固醇，100μM的单硫代甘油，1%(v/v)的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液，250μM的抗坏血酸-2-磷酸盐，1%（v/v）的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，0.5%（v/v）的青霉素/链霉素双抗溶液；

所述诱导生成前血小板形成细胞的方法为将巨核细胞谱系特异性祖细胞中的培养基更换成含有因子的MK培养基，细胞密度为10⁵/mL；39℃、5%CO₂中培养，培养至第3天，将细胞转移到37℃和5%CO₂下继续培养诱导，培养至第6天得到前血小板形成细胞；

所述含有因子的MK培养基，为MK培养基中添加终浓度为1ng/mL的干细胞因子，30ng/mL的血小板生成素，7.5ng/mL的白细胞介素6，13.5ng/mL的白细胞介素9，5μM的ROCK抑制剂Y27632和20 Units/mL的肝素；

所述MK培养基的配置方法为：50%(v/v)IMDM培养基、25%(v/v)F-12培养基和23% (v/v)无蛋白杂交瘤细胞培养基混合，添加终浓度为100μg/mL的rh白蛋白，0.05wt%的聚乙烯醇，0.25 μM的亚油酸，5μg/mL的合成胆固醇，100μM的单硫代甘油，1%(v/v)的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺溶液，250μM的抗坏血酸-2-磷酸盐，1%（v/v）的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，0.5%（v/v）的青霉素/链霉素双抗溶液。