[发明专利]一种诱导性多能干细胞制备通用血小板的方法

说明书

本发明提供一种诱导性多能干细胞制备通用血小板的方法，属于遗传工程技术领域，所述方法包括制备低免疫原性诱导性多能干细胞、诱导生成造血内皮细胞、诱导生成巨核细胞谱系特异性祖细胞、诱导生成前血小板形成细胞、收集血小板；所述制备低免疫原性诱导性多能干细胞为将诱导性多能干细胞的β2微球蛋白敲除，获得β2微球蛋白缺陷型诱导性多能干细胞，即低免疫原性诱导性多能干细胞；本发明制备通用血小板的方法，诱导分化时间为19天，诱导时间短，且可以大规模生产；且在大规模生产中，均可以从冻存的巨核细胞谱系特异性祖细胞直接诱导得到前血小板形成细胞，诱导时间更短，仅需要一周左右时间。

技术领域

本发明提供一种诱导性多能干细胞制备通用血小板的方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

血小板对于止血栓的形成是必不可少的。血小板输注疗法在临床上主要用于预防和治疗血小板数量减少或者功能异常所导致的出血，从而恢复和维持机体的止血和凝血功能。因此，血小板供应短缺对具有异常/罕见血型的输血依赖患者，特别是那些接受同种异体免疫的患者，以及经常发生血小板同种免疫的癌症或白血病患者会产生潜在的威胁生命的后果。

现有技术中，临床输注用血小板制剂依赖献血志愿者通过血细胞单采机进行单采血小板获取，单采获取的血小板制剂保质期很短，一般在4到5天。此外，来自捐献者的血小板始终面临被各种病原体污染的风险。与此同时，血小板输注在临床应用上还存在输注无效的情况，尽管首次输注时可以使用与患者不同类型的人白细胞抗原(HLA)的血小板，但当重复输血时，患者体内会产生针对相应HLA的特异性抗体，使得血小板在输注后迅速失效并被排斥。而且，血小板本身还具有特异性的人血小板抗原(HPA)，异体HPA同样也会导致血小板输注后迅速被排斥失效，造成免疫性输注无效的问题。

在这种情况下，已有相关研究者着手开发体外诱导成血小板的技术。十多年来，已经研究了来自骨髓 、脐带血或外周血的人类造血干细胞用于巨核细胞和血小板的生成。使用细胞因子、生长因子和/或基质饲养细胞的某些组合，已经从人类造血干细胞产生了功能性血小板，并取得了显着的成功。然而，人类造血干细胞仍然是从捐赠者那里收集的，在目前的培养条件下扩展能力有限，这会干扰大规模生产和未来的临床应用。人类胚胎干细胞可以在体外无限期地增殖和扩增，为人类治疗提供了一种可能取之不尽且无供体的细胞来源。在过去的十年中，已经广泛研究了人类胚胎干细胞在体外向造血细胞的分，但巨核细胞/血小板的产量和纯度较低。因此，开发异体来源的、低(无)免疫原性、可以随需随取、随取随用的人造血小板势在必行。

CN202110444119.8提供一种脐带来源间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法，公开了一种脐带来源的间充质干细胞制备的通用型血小板制剂及方法，即对脐带来源的间充质干细胞进行多阶段诱导处理，制备血小板制剂；其中，所述血小板为低免疫原性的通用型血小板。

上述专利存在以下缺陷：

①MSCs随着体外扩增时间增加而逐渐老化，且表面表达HLA-I（HLA-A.B.C）水平升高，虽然传代次数少的MSCs可以自我下调表面HLA-I表达，仍能够引起免疫应答，产生免疫记忆。

②MSCs诱导的血小板受MSCs传代次数的限制，因此不能进行大规模生产。

③诱导时间长：成脂诱导13天，血小板诱导10天，至少需要23天。

④在血小板诱导第8天，巨核系细胞成熟标志物CD42b的表达量最高，仅有33%。

⑤MSCs诱导制备的通用血小板表达HLA-D。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种诱导性多能干细胞制备通用血小板的方法，实现以下发明目的：

（1）本发明采用诱导性多能干细胞制备通用血小板的时间短且可以大规模生产；

（2）本发明诱导的前血小板形成细胞中血小板的标志物CD41a+、CD42b+血小板的表达量达83%；