[发明专利]利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法

权利要求书

1.一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

1）全肺类器官的构建

S1、诱导hPSC分化为定形内胚层：

S1中使用的培养基包括培养基A和培养基B，培养基A添加有人肌肉抑制素GDF8和CHIR99021，培养基B添加有人肌肉抑制素GDF8、人成纤维细胞生长因子2 FGF2和维生素C，hPSC依次分别在培养基A和培养基B中进行培养1-3天；GDF8的使用量为20-500ng/ml，CHIR99021的使用量为0.1-10μM，FGF2的使用量为1-100ng/ml，维生素C的使用量为5-300μg/ml；

S2、诱导定形内胚层分化为肺芽：

在S2进行前期阶段之前先使用培养基C培养1-3天，其中含有BMP抑制剂NOG、TGFβ抑制剂SB431542，且培养基中还添加EGM2；NOG的使用量为50-500ng/ml，SB431542使用量为1-50μM；

S2分为前期阶段和后期阶段，其中前期阶段使用培养基D和培养基E，后期阶段使用培养基F，前期阶段持续加入全反式维甲酸ATRA，保持ATRA的浓度为0.01-10μM；在培养基D中培养1-3天，培养基D添加有Wnt抑制剂IWP2、TGFβ抑制剂SB431542和全反式维甲酸ATRA，Wnt抑制剂使用量为0.1-10μM，TGFβ抑制剂使用量为1-50μM；在培养基E中培养2-5天，培养基E中添加肺上皮细胞相关诱导分化因子GSK-3抑制剂CHIR99021、人骨形成蛋白4 BMP4、人角质细胞生长因子KGF、人成纤维细胞生长因子10 FGF10和全反式维甲酸ATRA；其中，CHIR99021的使用量为0.1-10μM，BMP4的使用量为1-50ng/ml，FGF10的使用量为1-50ng/ml，KGF的使用量为1-50ng/ml；在培养基F中培养8-12天，培养基F在培养基E的基础上增加血管内皮细胞与巨噬细胞诱导分化的共性因子人上皮生长因子EGF、人血管内皮细胞生长因子VEGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF，同时减少全反式维甲酸的用量，并且在前期阶段和后期阶段的培养基中均添加EGM2，其中，EGF的使用量为1-50ng/ml，VEGF的使用量为0.5-100ng/ml，bFGF的使用量为0.5-50ng/ml，各阶段添加的EGM2的体积百分比为5%-60%；

S3、诱导肺芽分化为多谱系肺脏类器官；

采用含有I型胶原蛋白与III型胶原蛋白的ECM对肺芽进行包被，ECM用来模拟细胞生长的三维微环境，其中，ECM为三层结构，从下至上分别为A层、B层和C层；A层为100%Matrigel；B层为S2形成的肺芽和体积比40%的Matrigel、体积比40%的I型胶原蛋白、体积比20%的III型胶原蛋白；C层为100% Matrigel；随后使用培养基G进行培养，培养基G在培养基F的基础上再添加肺上皮促成熟因子，所述肺上皮促成熟因子为地塞米松、PDE抑制剂IBMX、PKA激活剂cAMP，地塞米松的使用量为10-1000nM，PDE抑制剂的使用量为0.01-1mM，PKA激活剂的使用量为0.01-1mM；培养最终得到全肺类器官；

2）肺纤维化疾病模型的构建

I）分别使用M1、M2极化诱导剂孵育全肺类器官，验证巨噬细胞具备向M1/M2型巨噬细胞极化的能力；

II）使用浓度为10-100μg/ml的博来霉素处理步骤1）得到的全肺类器官8-30天，诱导肺驻留巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，极化得到的M2型巨噬细胞分泌TGF-β1，使得培养上清中TGF-β1含量增加并作用于全肺类器官构建肺纤维化疾病模型。

2.根据权利要求1所述的利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，其特征在于：期间每48h更换培养基。