[发明专利]利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法

说明书

本发明提供了一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，该模型拥有致密而复杂的肺脏结构，可耐受体内通用诱导剂博来霉素的长期诱导，极大延长了纤维化模拟与药效分析的时间窗。除含有肺的主要上皮细胞类型外，模型中的巨噬细胞具备功能性，可忠实地还原肺驻留巨噬细胞通过分泌TGF‑β1而促进胶原沉积的病理机制。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法。

背景技术

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是最常见的特发性间质肺病，死亡率高于多数肿瘤，患者中位生存期仅2-3年。近20年来，＞70种抗纤维化药物虽在临床前模型上呈现显著药效，但均在临床试验遭遇失败。传统模型药物评价效力的不足，要求亟待建立更准确、可靠的新模型。随着再生医学的迅速发展，人源类器官技术从悄然诞生到备受瞩目。相比传统细胞模型，这些类器官在细胞种类、结构特征与功能特性上均表现出更好的生理相关性；而人源化的特点又能很好的克服动物模型由于物种差异所造成的结果偏差。

目前，肺类器官可由人多能干细胞（hPSC）或人成体干细胞（hASC）诱导分化产生。而无论是hPSC或hASC来源，其均主要由上皮细胞构成（如肺泡细胞、杯状细胞、纤毛细胞等），缺乏病理相关的重要细胞类型，如巨噬细胞。大量研究表明，在IPF中，驻留于肺的巨噬细胞主导了促炎因子分泌、抗炎因子分泌、前纤维化因子产生等一系列重要的病理分子事件；特别是由其产生的内源性TGF-β1（纤维化中枢信号），其直接导致了纤维化终末信号的激活，引发胶原沉积与纤维化瘢痕累积。因此，现有肺类器官模型缺乏巨噬细胞的现状限制了模拟纤维化的能力。

另一方面，除谱系缺失的问题，现有模型的结构缺陷则限制了纤维化模拟的准确性。目前，博来霉素是动物模型进行肺纤维化造模的通用型诱导剂，其诱发的纤维化特征类似于人体，故被广泛接纳与采用。然而，由于当下体外模型的结构十分简单（如单层细胞、囊泡样类器官等），往往难以耐受博来霉素的细胞毒性，尚未诱导出现纤维化表型便已大量死亡。因此，鲜有在体外模型中使用博来霉素的报道。“取而代之”的，只能利用纤维化的下游信号分子去直接触发纤维化表型（如TGFβ1、IL-11等），如此便忽视了许多中间过程发生的重要分子事件，如肺上皮细胞的受损老化、巨噬细胞极化与抗炎/促炎调控等，严重违背了体内纤维化发生发展的真实情况；这在一定程度揭示了基于此类模型的药效数据与临床结果大相径庭的原因。不仅如此，纤维化的形成本是日积月累的长效过程，而当下体外模型使用下游信号分子直接触发纤维化的时间普遍≤48h（动物中的博来霉素造模约20天左右），纤维化进展的全貌与相应药效也由此变得难以捕获。

综上，1）缺乏功能性巨噬细胞和2）结构过分单一的问题严重限制了当下肺类器官模型模拟纤维化的能力。倘若存在一个具备功能性巨噬细胞的肺类器官，同时拥有更好的结构性以耐受体内通用诱导剂博来霉素的长期造模过程，则有望从头地、精准地在体外模拟纤维化病理的发生发展，为抗纤维化药物测试提供一个可靠的人源评价工具。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种基于全肺类器官的博来霉素诱导肺纤维化的方法，该肺类器官不仅在兼具了功能性巨噬细胞与上皮细胞，且具备致密而复杂的肺脏结构特征，能够耐受博来霉素的长时间诱导。凭借此全新的纤维化疾病模型，我们不但于体外呈现了纤维化标志物基因/蛋白的上调，还忠实还原了肺驻留的巨噬细胞通过分泌TGF-β1而促进胶原沉积的机制，因此适合作为新一代IPF体外疾病模型，用于纤维化进展的全程模拟与抗纤维化药物的精准筛选。

为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：

一种利用博来霉素体外构建肺纤维化疾病模型的方法，该方法包括如下步骤：

1）全肺类器官的构建