[发明专利]一种体外原代微肿瘤模型的构建方法及应用

说明书

本申请公开了一种体外原代微肿瘤模型的构建方法及应用，构建方法，包括如下步骤：从原代肿瘤组织中分离得到原代细胞；利用光固化生物3D打印所述原代细胞，完成原代微肿瘤模型的构建；及在药物筛选中的应用。本申请构建的体外原代微肿瘤模型包括原代肿瘤细胞、原代免疫细胞、原代癌症相关基质细胞、细胞外基质材料和培养基成分，保留了肿瘤细胞以外的其它原代细胞，更好地还原了肿瘤微环境，具有更好的临床相关性。本申请通过光固化3D打印方法构建，1分钟内成型，外形和基质属性可控，形状精度达到10μm，建模成功率90％，通量高，成本低。本申请能够用于药敏测试，测试周期为1周。

技术领域

本申请属于药效评价技术领域，具体涉及一种体外原代微肿瘤模型的构建方法及应用。

背景技术

在药物开发的过程中，传统的体外药效研究模型为2D模型，即对2D贴壁培养的肿瘤细胞进行药敏测试。该方法存在的问题为2D模型的生理相关性差，主要表现在以下方面：(1)肿瘤组织在体内呈三维立体结构(3D状态)，2D贴壁培养的肿瘤细胞在细胞表型上与真实组织中的3D粘附的肿瘤细胞有很大差异；(2)真实肿瘤组织中的肿瘤细胞与该组织中的其他细胞，包括免疫细胞、基质细胞，以及细胞外基质等其它因素存在相互作用，生长在特定的肿瘤微环境中，而2D模型无法模拟这些环境因素；(3)3D肿瘤组织在养分、氧气、药物等物质的交换和渗透方面，与2D模型存在明显的区别。所有上述这些生理相关性的差异，导致传统2D模型不能真实地反映候选药物的疗效，与体内效果差异较大。

近几十年来，一种病人来源肿瘤异种移植(Patient-derived tumor xenograft,PDX)的动物肿瘤模型在药物筛选和个性化治疗领域得到运用和发展。该技术是将来源于患者的肿瘤组织、原代细胞植入免疫缺陷小鼠的体内形成移植肿瘤模型。PDX模型在组织病理学、分子生物学和基因水平上保留了大部分原代肿瘤的特点、具有较好的临床疗效预测性。PDX造模一般方法步骤：将病人的新鲜肿瘤切成毫米级的小块，将肿瘤小块混合Matrigel和培养基后接种到小鼠腹侧。接种后观察肿瘤在小鼠体表的生长情况，在肿瘤生长至10mm左右时处死小鼠取得第一代肿瘤，重复上述操作以扩增和传代肿瘤组织。每一代组织都可以冻存以备后续药物筛选和精准医疗的研究需要。PDX模型存在的缺点如下：建模难度高、周期长，一般每代肿瘤接种后生长时间在3-6个月；成功率低，一般能成功成瘤的动物数量不到2/3；建模和维持成本高，通量低；大量使用动物，具有伦理争议。这些缺点使得它运用于指导肿瘤手术病人用药方面变得不可行。

近二十年来发展出一种肿瘤类器官(Patient-derived organoid,PDO)技术，作为一种3D体外肿瘤模型被运用于药物筛选领域。肿瘤类器官用取自患者体内的原代肿瘤，在实验室中经清洗、消化后分离出肿瘤细胞，然后选择Matrigel等材料作为3D培养的细胞外基质进行细胞培养，肿瘤细胞经过多次扩增和传代，最后形成微球状体外类器官肿瘤模型。该模型较好地模拟了原代肿瘤组织的特征，保留了肿瘤个体间的异质性，提高了药物筛选和个性化治疗的临床相关性。同时，PDO技术也存在如下缺点：原代肿瘤组织中的细胞在类器官的培养过程中经多次扩增和传代后，除肿瘤细胞外的其余细胞逐渐凋亡，形成的类器官丢失部分细胞间相互作用的微环境；不同肿瘤类器官生长高度依赖Matrigel材料作为细胞外基质，该材料为生物提取材料，成分复杂不明确，批次间不稳定，同时，形成的细胞外基质的理化性质不可调，不能模拟不同肿瘤组织的力学和理化特性；肿瘤类器官的培养时间2-4周不等，周期较长。

现阶段药物研发上亟需一种可以替代传统药效模型的新技术，能够提高模型与临床用药的相关性，降低新药开发成本与风险。

发明内容

针对上述现有技术的缺点或不足，本申请要解决的技术问题是提供一种体外原代微肿瘤模型的构建方法及应用。

为解决上述技术问题，本申请通过以下技术方案来实现：

本申请提出一种体外原代微肿瘤模型的构建方法，包括如下步骤：

从原代肿瘤组织中分离得到原代细胞；