[发明专利]一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法

说明书

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，包括以下步骤：大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b发酵液经过菌体收集、匀浆破菌获得包涵体，包涵体经洗涤、变性溶解及稀释复性，再进行浓缩，所述浓缩包括：吸附剂前处理；复性液前处理；往前处理后的吸附剂中加入pH为2～3的水匀浆，然后加入前处理后的复性剂，搅拌吸附5～50min，置于0～6℃下放置1～5h，收集沉淀，沉淀倒入布氏漏斗中，抽真空，采用洗脱液1洗脱，流出液不收集，然后用洗脱液2淋洗，收集流出液。本发明的浓缩方法可以快速达到浓缩目的，提高蛋白收率，还能有效去除复性沉淀、悬浮物、大分子粘稠的核糖核酸、疏水弱的杂蛋白等。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒的蛋白质，根据干扰素氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为三类：α干扰素、β干扰素以及r干扰素，其中α干扰素是应用最为广泛的一类干扰素。重组人干扰素α2b具有广普抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增值以及提高免疫功能等作用，可以用来治疗病毒性乙型肝炎、丙型肝炎、病毒性脑膜炎、病毒性眼感染、肾癌、毛细白血病、恶性皮肤淋巴瘤、成骨肉瘤、多发性硬症等。

目前工业化生产的重组人干扰素α2b多以不溶性包涵体形式表达，不溶性包涵体的形成主要有两个原因：(1)重组人干扰素α2b大肠杆菌中高效表达，产量很高，容易相互聚集形成包涵体；(2)含二硫键的重组人干扰素α2b在大肠杆菌胞浆中表达，因处在还原状态的细胞环境中，重组人干扰素α2b会形成错误的二硫键导致形成沉淀。包涵体是原核细胞表达的产物，是没有生物活性的蛋白质聚集体，所以在工业化生产重组人干扰素α2b的过程中，需要破碎细胞提取包涵体、并对包涵体进行变性溶解、复性(重新折叠恢复活性)以恢复干扰素自然空间折叠状态，成为具有生物活性的粗制干扰素。

包涵体被变性溶解后，再进行进一步的体外折叠，使蛋白质恢复天然构象，即蛋白复性。在工业化生产中，主要有两种重新折叠恢复蛋白活性方式：稀释法和透析法。采用稀释法的回收率明显高于透析法复性，若采用透析法要达到相同的复性效果，则无法实现工业化生产。但稀释复性法对样品体积约百倍的稀释，会使样品的体积急剧增大，使色谱柱分离进样时间冗长，还需膜超滤去除影响柱分离的成份如变性剂、使柱压能大幅升高的粘稠大分子核酸和微浑浊物质等，增加了分离时间又降低了分离效果。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法。

本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：一种分离浓缩重组人干扰素α2b复性液的方法，包括以下步骤：

S1、获得包涵体：将大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b发酵液离心和/或过滤方式获得菌体，加入pH为8.0～9.0的含50～200mM氯化钠的Tris-EDTA缓冲液和溶菌酶，搅拌至粘稠状后置于0～6℃下6～20小时；然后匀浆破菌，收集沉淀即为粗包涵体；

S2、洗涤包涵体：往步骤S1获得的粗包涵体中加入洗涤液1，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀1；在沉淀1中加入洗涤液2，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀2；在沉淀2中加入洗涤液3，磁力搅拌1～5小时，收集沉淀3；

S3、包涵体变性溶解：往步骤S2收集的沉淀3中加入变性液，置于0～6℃下磁力搅拌4～10小时，离心去沉淀收集变性溶解液；

S4、稀释复性：将复性稀释液1缓慢加入磁力搅拌的步骤S3获得的变性溶解液中得到复性稀释第一步液；将复性稀释第一步液缓慢加入到磁力搅拌的复性稀释液2中，搅拌均匀，置于0～6℃下放置1～5天，得复性液；