[发明专利]一种利用内生菌防治腐烂病的方法

权利要求书

1.一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：产紫青霉的制备，将梨树腐烂病发病枝干韧皮部剥离，剪成组织块，投放于75％的

乙醇中消毒；将步骤再用1％次氯酸钠消毒，组织经无菌水清洗5次后置于含氨苄青霉素的

PDA培养基表面；待组织块周围长出菌丝，挑针挑取菌落边缘菌丝或菌块，转移至新的培养

基中进行纯化培养；经单孢纯化后得到单一菌株保存备用；

S2：制备无菌滤液，将内生真菌JK2接种PDA平板上，在25℃下培养7d；用无菌水将孢子

洗脱后，用血球计数板统计浓度，并将其调整为10 8个/mL；接种1mL孢子液于50mL PDB培养

基中，获得的发酵液过滤，即得无菌滤液；

S3：制备带毒平板，取无菌滤液与冷却到50℃的PDA培养基混合倒入平板，制成不同浓

度(10％和20％)的带毒平板，以无菌水代替无菌滤液与PDA培养基混合；

S4：梨树枝条的选取，选取健康、长势一致当年生梨树枝条，经无菌水清洗干净后，用

75％乙醇擦拭消毒，再用无菌水清洗，晾干；

S5：用打孔器在枝条打孔，孔深至木质部；分别用内生真菌上清液或分生孢子(10 8个/

mL)喷施处理打孔枝条，无菌水处理作为阴性对照，戊唑醇处理作为阳性对照；

S6：处理后将枝条置于培养箱中保湿2d后，每个孔接种1个直径为0 .5cm的梨树腐烂病

菌菌饼，再用蘸无菌水的脱脂棉缠绕，外用封口膜缠绕保湿，置于25℃下光照培养箱中培

养。

2.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S1中乙

醇消毒时间为1min，且组织块的规格为0.5cm×0.5cm。

3.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S1中次

氯酸钠的消毒时间为3min，所述培养基的成分为马铃薯200g·L-1、葡萄糖20g·L-1和琼脂

粉15g·L-1；其中氨苄青霉素的含量为100mg·L-1。

4.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S3中培

养液于25℃、

180r/min条件下振荡培养7d。

5.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S3中，

发酵液经10000r/m离心20min后，取上清液用0.22μ

m微孔滤膜过滤。

6.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S5中打

孔器所用的直径为0.5cm。

7.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S6中的

枝条7d后测量病斑长度，并拍照记录。

8.根据权利要求1所述的一种利用内生菌防治腐烂病的方法，其特征在于，所述S6中每

次接种10个孔，重复3次，发病率＝(总接种点数-无病症的接种点数)/总接种点数*100％。