[发明专利]太子参环肽B体内生物合成表达载体及构建方法和合成方法

权利要求书

1.一种太子参环肽B体内生物合成表达载体，其特征在于，包括：质粒、基因MBP、基因TEV、TEVsite和HB序列、基因GmPOPB和启动子J23100，连接顺序为质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB。

2.根据权利要求1所述的太子参环肽B体内生物合成表达载体，其特征在于，质粒为pET28a。

3.权利要求1或2所述的太子参环肽B体内生物合成表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)PCR扩增基因MBP，并在其末端引入TEVsite序列，得到MBP-TEVsite；

(2)利用PCR技术在TEV基因末端加入TEVsite和HB序列，得到TEV-TEVsite-HB；

(3)将质粒与步骤(1)和步骤(2)所得片段连接，得到质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB；

(4)利用PCR技术在GmPOPB基因的N端引入启动子J23100序列，得到J23100-GmPOPB；

(5)在质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB终止密码子的末端通过重组连接的方法插入J23100-GmPOPB，得到表达载体质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB。

4.采用权利要求1或2所述的太子参环肽B体内生物合成表达载体体内生物合成太子参环肽B的方法，其特征在于，包括以下步骤：

质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB中含有两个启动子，分别为启动子T7和启动子J23100，启动子J23100启动GmPOPB蛋白酶的表达，接着T7启动子在诱导剂的作用下启动MBP融合蛋白的表达，融合蛋白中在MBP蛋白标签、TEV蛋白和线性肽HB之间分别引入了TEVsite切割位点，融合蛋白表达时，TEV蛋白分别识别两处切割位点，使得线性肽HB分离出来，分离的线性肽HB在GmPOPB蛋白酶的催化作用下形成环肽HB。

5.一种太子参环肽B的提取方法，其特征在于，对权利要求1或2所述的表达载体质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB进行诱导表达，然后破碎细胞后去除破碎液中的杂蛋白后提取太子参环肽B。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，去除破碎液中的杂蛋白的方法为加热处理法、甲醇处理法、萃取处理法。

7.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，加热处理时，温度为50-100℃，时间为5-60min。

8.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，甲醇处理法是将向破碎液中加入甲醇去除杂蛋白，甲醇的体积分数为10-70％，处理时间为5-60min。

9.根据权利要求6所述的提取方法，其特征在于，萃取处理法具体为：利用乙酸乙酯对破碎液进行萃取，萃取时间为20-40min。

10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，萃取时间为30min。