[发明专利]太子参环肽B体内生物合成表达载体及构建方法和合成方法

说明书

本发明公开了一种太子参环肽B体内生物合成表达载体及构建方法和合成方法，本发明选择GmPOPB作为体内合成环肽HB的蛋白酶，构建了pET28a‑MBP‑TEVsite‑TEV‑TEVsite‑HB‑J23100‑GmPOPB共表达载体，共表达载体含有两个启动子，其中T7启动子启动MBP融合蛋白的转录翻译，同时TEV蛋白酶识别切割位点完成线性HB前体与融合标签的分离，J23100启动子启动GmPOPB蛋白酶的转录翻译。细胞内线性HB前体在GmPOPB蛋白酶的催化下形成环肽HB，通过破碎细胞提取环肽HB。本发明通过体内生物合成方法合成太子参环肽B，该过程简单，成本低，可用于大规模制备环肽HB。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种太子参环肽B体内生物合成表达载体及构建方法和合成方法。

背景技术

植物环肽是植物生命周期不同时期合成的一类重要天然产物，研究表明从各种植物分离的环肽在抗虫、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗凝、免疫抑制、舒张血管等方面具有良好的生物活性，具有重要开发价值。直接从植物中提取环肽不仅步骤繁琐，而且提取的总植物环肽中环肽种类繁多不易分离，同时直接提取成本也较高。生物法体外催化合成环肽较于传统从植物中提取环肽，简化了实验步骤，可以得到想要的单一种类的环肽，但是不适用于大规模制备环肽。虽然已经实现了制备线性肽底物，但合成环肽的成本依然较高。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种太子参环肽B体内生物合成表达载体及构建方法和合成方法，以解决现有环肽合成过程复杂，成本高，不能大规模制备的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种太子参环肽B体内生物合成表达载体，包括质粒、基因MBP、基因TEV、TEVsite和HB序列、基因GmPOPB和启动子J23100，以质粒为载体连接基因MBP，然后在基因MBP末端依次连接TEVsite序列和基因TEV，基因TEV末端连接TEVsite和HB序列，HB末端连接启动子J23100和基因GmPOPB，该表达载体具体为质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB。

进一步地，质粒为pET28a，表达载体具体为pET28a-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB。

上述太子参环肽B体内生物合成表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增基因MBP，并在其末端引入TEVsite序列，得到MBP-TEVsite；

(2)利用PCR技术在TEV基因末端加入TEVsite和HB序列，得到TEV-TEVsite-HB；

(3)将质粒与步骤(1)和步骤(2)所得片段连接，得到质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB；

(4)利用PCR技术在GmPOPB基因的N端引入启动子J23100序列，得到J23100-GmPOPB；

(5)在质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB终止密码子的末端通过重组连接的方法插入J23100-GmPOPB，得到表达载体质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB。

采用上述太子参环肽B体内生物合成表达载体体内生物合成太子参环肽B的方法，包括以下步骤：

质粒-MBP-TEVsite-TEV-TEVsite-HB-J23100-GmPOPB中含有两个启动子，分别为启动子T7和启动子J23100，启动子J23100启动GmPOPB蛋白酶的表达，接着T7启动子在诱导剂的作用下启动MBP融合蛋白的表达，融合蛋白中在MBP蛋白标签、TEV蛋白和线性肽HB之间分别引入了TEVsite切割位点，融合蛋白表达时，TEV蛋白分别识别两处切割位点，使得线性肽HB分离出来，分离的线性肽HB在GmPOPB蛋白酶的催化作用下形成环肽HB。