[发明专利]一种纳豆激酶的提纯方法

权利要求书

1.一种纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，该方法包括在将纳豆激酶发酵液进行酶解，之后将所得酶解液进行纯化；所述酶解的方法包括：将纳豆激酶发酵液采用水稀释至粘度为180-250mPa.s，再将所得纳豆激酶稀释液采用酶制剂酶解成酶解液，所述酶制剂选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶、聚谷氨酸多肽酶和β-内酰胺酶中的至少一种，所述酶制剂的添加量为纳豆激酶发酵液体积的0.1％-5％，所述酶解的条件使得酶解液的粘度降低至100mPa·s以下。

2.根据权利要求1所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，所述酶解的条件使得酶解液的粘度降低至7-10mPa.s；优选地，所述酶解的条件包括温度为30-50℃，时间为15-120min。

3.根据权利要求1所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，所述纯化的方法包括依次进行的以下步骤：

S1、微滤：将酶解液采用孔径为50-500nm的陶瓷膜进行微滤，所得透过液为纳豆激酶酶清液；

S2、超滤：将纳豆激酶酶清液采用截留分子量为2-25kDa的超滤膜进行超滤，所得截留液为纳豆激酶浓缩液；

S3、盐析：将纳豆激酶粗酶液进行盐析后固液分离，所得固体产物为纳豆激酶粗品；

S4、精制：将纳豆激酶粗品依次采用柱层析纯化和电泳纯化，得到纳豆激酶纯品。

4.根据权利要求3所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，步骤S1中，所述微滤的条件包括酶解液的温度为10-50℃，膜压力为0.1-0.6MPa，所述微滤的时间以使透过液的体积达到酶解液体积的85％-90％时为准。

5.根据权利要求3所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，步骤S2中，所述超滤的条件包括纳豆激酶酶清液的温度为8-40℃，膜压力为0.01-0.5MPa，所述超滤的时间以使截留液与纳豆激酶发酵液的体积比达到1:(3-20)时为准。

6.根据权利要求3所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，步骤S3中，所述盐析的方式为往纳豆激酶粗酶液中加入金属盐Ⅰ，搅拌至金属盐Ⅰ基本溶解后静置以完成一级盐析，再将所得一级盐析液进行一级固液分离，往所得液体产物中加入金属盐Ⅱ，搅拌至金属盐Ⅱ基本溶解后将溶液的pH值调节至7-10，之后于4-10℃下静置以完成二级盐析，再将所得二级盐析液进行二级固液分离，所得固体产物即为纳豆激酶粗品。

7.根据权利要求6所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，所述金属盐Ⅰ和金属盐Ⅱ各自独立地选自硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、氯化钠和氯化钾中的至少一种；优选地，所述一级盐析的盐饱和度为5-50％，所述二级盐析的盐饱和度为30-80％；优选地，所述一级盐析的时间为1-25h，所述二级盐析的时间为1-48h。

8.根据权利要求3所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，步骤S4中，所述柱层析纯化和电泳纯化的方法为将填料活化后装入层析柱中，以磷酸盐缓冲液进行平衡，将纳豆激酶粗品用水复溶配制成上样液后上样，之后用含氯化钠的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集富含纳豆激酶的洗脱液并进行电泳，将带有纳豆激酶亮条带的层析液真空干燥，即得到纳豆激酶纯品。

9.根据权利要求8所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液以及含氯化钠的磷酸盐缓冲液的pH值各自独立地为6-10，浓度各自独立地为0.1-10.0mol/L；优选地，所述含氯化钠的磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为0.05-5mol/L；优选地，所述上样液中纳豆激酶的浓度为5-100mg/mL；优选地，所述上样液的量为层析柱体积的1％-50％；优选地，所述洗脱的流速为0.2-5BV/h。

10.根据权利要求3所述的纳豆激酶的提纯方法，其特征在于，步骤S4中，所述柱层析纯化所采用的填料选自葡聚糖凝胶、阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和大孔吸附树脂中的至少一种。