[发明专利]一种纳豆激酶的提纯方法

说明书

本发明属于化合物提纯技术领域，涉及一种纳豆激酶的提纯方法，包括在将纳豆激酶发酵液进行酶解，之后将所得酶解液进行纯化；所述酶解的方法包括将纳豆激酶发酵液采用水稀释至粘度为180‑250mPa.s，再将所得纳豆激酶稀释液采用酶制剂酶解成酶解液，所述酶制剂选自胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶、聚谷氨酸多肽酶和β‑内酰胺酶中的至少一种，所述酶制剂的添加量为纳豆激酶发酵液体积的0.1％‑5％，所述酶解的条件使得酶解液的粘度降低至100mPa·s以下。采用本发明提供的方法不仅能够获得较高的酶蛋白收率和纯度，而且还能够降低酶活损失。

技术领域

本发明属于化合物提纯技术领域，具体涉及一种纳豆激酶的提纯方法。

背景技术

血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，是现今仅次于癌症的第二大病症。在我国，人们生活水平的提高和生活方式的改变导致日常膳食中高脂肪、高蛋白摄取过量。而老龄化社会的到来，使得血栓性疾病成为第一大健康隐患，每年需要进行溶血栓治疗的人数超过300万，每年死于心脑血管疾病的人数约为200万，占因病死亡总人数的40.7％。因此，发展高效特异性溶栓药物是防治心脑血管疾病的重要手段，但溶栓药物所引起的不良反应也引起了人们的重视，如内出血、再梗死、过敏反应等，因此寻找和开发新型溶栓剂是心脑血管疾病治疗的重要内容。

研究表明，微生物的代谢产物是一种重要的溶栓酶来源，其中由枯草芽孢杆菌的亚种——纳豆芽孢杆菌经发酵产生的纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种高纤溶活性的丝氨酸蛋白酶，相较目前已应用于临床的尿激酶(Urokinase，UK)、链激酶(Streptokinase，SK)而言具有安全性高、溶栓效果好、出血倾向小、体内半衰期长、易吸收、成本低廉等优点。纳豆激酶在冷冻环境下本身性质较为稳定，在24-30个月内有较高的酶活保持率。

纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌在发酵过程中产生的次级代谢产物，因其良好的溶栓作用被广大消费者所熟知，近年来针对纳豆激酶的提取纯化及相关产品开发等研究逐渐成为该领域的研究热点。例如，CN103589706B公开了一种纳豆激酶的提纯方法，该方法通过离心和超滤对纳豆激酶发酵液进行预处理得到超滤浓缩液，再经过葡聚糖凝胶初步层析、阳离子树脂与阴离子树脂分步层析得到纯化后的浓缩液，之后在4℃环境下结晶并干燥得到纳豆激酶纯品。此法虽然能够得到较纯的纳豆激酶成品，但柱层析后透析除盐以及多次过柱使得整个纯化工艺耗时长、操作繁琐，而且频繁过柱层析增大了酶蛋白损失的风险，不适于工业放大生产。又如，CN1690196A公开了一种反胶团法分离纯化纳豆激酶的方法，该方法先低速离心处理纳豆激酶发酵液得到粗酶液，将粗酶液与萃取剂按比例混合进行萃取，然后再将萃取相与反萃取剂按比例混合进行反萃取，高速离心得到纯化后的纳豆激酶溶液，结晶干燥后得到纳豆激酶成品。此法虽然工艺简单、操作方便，但是萃取剂和反萃取剂中含有乙醇、丙醇、异丙醇等有机溶剂，对酶蛋白有一定的破坏作用，且采用萃取的方式进行纯化存在纯化倍数低、萃取不彻底以及溶剂残留等问题，纯度较低，综合来看此法也不适于放大后的产业化生产。

发明内容

本发明的目的是为了克服采用现有的方法对纳豆激酶发酵液进行分离提纯时存在酶蛋白收率或纯度较低以及酶活损失大的问题，而提供一种新的纳豆激酶的提纯方法，采用本发明提供的方法不仅能够获得较高的酶蛋白收率和纯度，而且还能够降低酶活损失。