[发明专利]一种灰楸叶片不定芽诱导及植株再生的方法

说明书

本发明提供了一种灰楸叶片不定芽诱导及植株再生的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法包括S1、灰楸枝条材料的采集及消毒处理；S2、接种到诱导培养基中培养得到分化芽，增殖培养获得不定芽，进行生根培养获得无菌苗；S3、将无菌苗的叶片作为外植体，接种到诱导愈伤培养基中，进行初级诱导，获得初级愈伤组织；S4、初级愈伤组织转接到分化诱导培养基进行不定芽的诱导培养及植株再生；S5、炼苗后移栽。本发明的方法以灰楸无菌苗叶片为外植体，经过愈伤间接途径实现再生的技术，该方法可以减少遗传转化后嵌合体的发生概率。本发明的方法解决了灰楸叶不定芽再生困难的问题，不定芽诱导率达到80%以上，远高于现有报道的叶片再生效率。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种灰楸叶片不定芽诱导及植株再生的方法。

背景技术

灰楸为紫葳科梓树属高大落叶乔木，是优良园林绿化树种和珍贵的家具用材。由于灰楸自交不亲和性，结实出种率低，种子萌发率也不高，采用播种育苗比较困难。因此，灰楸繁育多采用埋根摧芽育苗法和嫩枝扦插育苗法，但埋根育苗法存在种根较少、繁殖材料不足的问题，在实际生产中难以大量种植推广；扦插育苗法则存在生根率、成活率不高的瓶颈。

通过植物组织培养的无性繁殖技术可以不受季节限制，短期内实现优良品种的快速扩增，缓解灰楸在生产中供不应求的现状。然而，目前灰楸组培快繁多以带腋芽茎段为外植体，但利用带腋芽茎段为外植体开展的遗传转化技术不稳定，获得的转基因植株嵌合体概率高；以不带腋芽的茎段为外植体，存在诱导率低、分化效率不高，扩繁无菌苗工作量大等问题；现有以叶片为外植体的直接再生报道，但是再生效率低仅有11.3%，很难满足灰楸在生产和科研上的双重需求。本发明利用灰楸叶片为外植体建立无性繁殖体系，通过诱导愈伤途径再生出不定芽，进而形成完整植株，提高了灰楸的再生效率。此外，人们要想针对灰楸目标性状进行遗传改良，必须建立灰楸叶片高效再生体系，通过农杆菌介导的方法实现遗传转化，本发明的建立无疑为灰楸优良种质的保存及扩繁，分子机理及遗传转化研究提供了技术支撑。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种灰楸叶片不定芽诱导及植株再生的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种灰楸叶片不定芽诱导及植株再生的方法，其包括如下步骤：

S1、灰楸枝条材料的采集及消毒处理；

S2、消毒处理后的灰楸枝条带腋芽的小段接种到诱导培养基中培养得到分化芽，将分化芽接种增殖培养基进行增殖培养获得不定芽，将增殖得到的不定芽截成带腋芽的茎段，转接到生根培养基生根培养获得无菌苗；

S3、将取无菌苗的叶片作为外植体，接种到诱导愈伤的培养基中，进行愈伤组织的初级诱导，获得初级愈伤组织；

S4、初级愈伤组织转接到分化诱导培养基进行不定芽的诱导培养及植株再生；

S5、将不定芽生根培养出的再生植株置于人工智能气候控制室炼苗后移栽。

如上所述的方法，优选地，在步骤S1中，灰楸枝条材料为在每年的3-5月份采集灰楸未萌动一年生枝条，在温室水培催芽，待萌发芽长10 cm-15cm时采集，去掉叶片和叶柄，只留茎段。

如上所述的方法，优选地，在步骤S1中，消毒处理为自来水冲洗30min后，用5%的次氯酸钠浸泡5-6min，无菌水冲洗后在超净台进行二次消毒。用75%的酒精浸泡30s-45s后，用无菌水冲洗4-5次，然后用10%的次氯酸钠消毒5 min，无菌水冲洗4-5次。

如上所述的方法，优选地，在步骤S2中，诱导培养基为DKW基本培养基中含有浓度为1.0mg/L的6BA、浓度为0.2mg/L的IBA、浓度为30 g/L蔗糖和浓度为3g/L的植物凝胶，pH为5.8的培养基；