[发明专利]增加植物中病毒样颗粒的产率

说明书

本申请涉及增加植物中病毒样颗粒的产率。提供一种在植物中生产病毒样颗粒(VLP)的方法。该方法包括将第一核酸和第二核酸引入该植物或该植物的部分。该第一核酸包含在植物中具有活性并且有效连接到编码病毒结构蛋白之核苷酸序列的第一调节区。第二核酸包含在植物中具有活性并且有效连接到编码通道蛋白(例如但不限于质子通道蛋白)之核苷酸序列的第二调节区。将该植物或该植物的部分在容许该核酸表达的条件下培养，从而生产VLP。

本申请是申请号为201280047819.2的发明名称为“增加植物中病毒样颗粒的产率”的中国专利申请的分案申请，原申请是2012年09月28日提交的PCT国际申请PCT/CA2012/050681于2014年03月28日进入中国国家阶段的申请。

技术领域

本发明涉及在植物中生产病毒蛋白。更特别地，本发明涉及在植物中生产并且增加病毒样颗粒生产。

背景技术

流行性感冒是由正粘病毒科(orthomyxoviridae)的RNA病毒引起。这些病毒有三种类型并且它们引起三个不同类型的流行性感冒：甲型、乙型与丙型。甲型流感病毒感染哺乳动物(人、猪、雪貂、马)以及鸟类。由于此类型病毒是已造成全世界流行病，因此对于人类是非常重要的。乙型流感病毒(又简称为乙型流感)仅感染人类。它偶尔引发流感的地方性爆发。丙型流感病毒亦仅感染人类。它们感染大多数年轻的人类并且鲜少造成严重的疾病。

疫苗接种通过在感染前诱导对象建立防御而提供对由类似物质引起之疾病的保护。通常，通过使用活的减毒形式或完整的失活形式的感染性物质作为免疫原而实现这一目的。为了避免使用全病毒(例如杀死的或减弱的病毒)作为疫苗的危险，已将重组病毒蛋白例如亚单位(subunit)实行为疫苗。肽与亚单位疫苗两者皆受到一些潜在的限制。由于不正确的折叠或差的抗原呈递，亚单位疫苗可能表现差的免疫原性。主要问题为确保工程蛋白质的构型模拟抗原在其自然环境中之构象的困难。必须使用适合的佐剂以及对于肽来说使用载体蛋白来加强免疫应答。此外，这些疫苗主要引起体液应答，并因此可能无法引起有效的免疫。亚单位疫苗对于可证实以完整的失活病毒提供保护的疾病经常是无效的。

病毒样颗粒(VLP)为纳入免疫原性组合物的潜在候选。VLP十分近似于成熟的病毒粒子，但它们不包含病毒的基因组物质。因此，VLP本质上为不可复制的，使得将它们作为疫苗施用是安全的。此外，可将VLP改造为在VLP的表面上表达病毒糖蛋白，这是其最天然的生理构型。此外，因为VLP类似完整的病毒粒子并且为多价颗粒结构，所以比起可溶的包膜蛋白抗原，VLP在引发对糖蛋白的中和抗体上可能是更有效。

已在植物中(WO2009/009876；WO 2009/076778；WO 2010/003225；WO 2010/003235；WO 2011/03522；WO 2010/148511；将其通过参考并入本文)，以及在昆虫和哺乳动物系统中(Noad,R.and Roy,P.,2003,Trends Microbiol 11:438-44；Neumann et al.,2000,J.Virol.,74,547-551)生产VLP。Latham与Galarza(2001,J.Virol.,75,6154-6165)报道了在以共表达血细胞凝集素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M1和M2基因的重组杆状病毒感染的昆虫细胞中流感VLP的形成。此研究证实了于真核细胞中共表达后流感病毒粒子蛋白的自组装，以及需要M1基质蛋白供VLP产生。然而，Gomez-Puertas et al.(1999,J.Gen.Virol,80,1635-1645)亦显示M2的过表达完全阻断CAT RNA传输至MDCK培养物。

M2作用为离子通道蛋白并且已显示当过表达此蛋白质时，共表达的HA之胞内运输被抑制，以及血细胞凝集素(HA)在细胞膜的累积减少75-80％(Sakaguchi et al.,1996；HenkelWeisz,1998)。此外，通过过表达M2，病毒膜蛋白在细胞膜的累积降低，因而产生的功能性VLP数目急剧降低。