[发明专利]一种基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系构建与制备方法在审
| 申请号： | 202310132812.0 | 申请日： | 2023-02-20 |
| 公开（公告）号： | CN116286707A | 公开（公告）日： | 2023-06-23 |
| 发明（设计）人： | 王小强;刘承琨;李丽娜;李计强;黄方 | 申请（专利权）人： | 中国石油大学（华东） |
| 主分类号： | C12N9/10 | 分类号： | C12N9/10;C07K19/00;C12N15/54;C12N15/62;C12N15/81;C12P19/56;C12R1/84 |
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| 地址： | 266580 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 导流 原理 催化 斯替维醇糖基化 功能 融合 体系 构建 制备 方法 | ||
1.一种基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)基于导流级联反应原理，设计多肽连接序列，介导UGT91C1融合在UGT76G1的C末端；
(2)通过计算机辅助设计，确定UGT91C1-UGT76G1融合酶的多肽连接序列为GGGGS；
(3)UGT91C1-UGT76G1融合酶基因及其表达质粒的构建；
(4)UGT91C1-UGT76G1融合酶在毕赤酵母中的重组表达及后序纯化；
(5)UGT91C1-UGT76G1融合酶催化转化制备多糖基化斯替维醇的性能表征。
2.根据权利要求1所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，其基因序列和蛋白一级结构分别为：Seq ID NO.1和SeqID NO.2。
3.根据权利要求2所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，步骤1中UGT91C1和UGT76G1为野生型序列，也可以是其突变体。
4.根据权利要求3所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，步骤2中多肽连接序列可以是GGGGS、EAAAK或EPPPP，但不限于这几种。
5.根据权利要求4所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，步骤3中使用的质粒是pPICZA、Pet-22b和Pet-28a，但不仅限于这三种。
6.根据权利要求5所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，步骤4中重组制备的体系是毕赤酵母、大肠杆菌和酿酒酵母，但不仅限于这几种。
7.根据权利要求6所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，步骤5中催化性能表征采用高效液相法和UDP-Glo糖基转移酶检测试剂盒法，但不仅限于这两种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系的构建与制备方法，其特征在于，利用底物导流原理构建融合酶，用于高效催化制备多糖基化的斯替维醇，可以避免中间产物扩散到体相，而是直接进入下一步级联反应，从而快速推动级联反应平衡向生成产物方向移动、减少中间产物分离和纯化，符合绿色化学合成理念。
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