[发明专利]一种基于底物导流原理的催化斯替维醇糖基化的双功能融合酶体系构建与制备方法

说明书

本发明提出了一种基于底物导流原理和计算机辅助对UGT91C1‑UGT76G1融合酶进行构建，并结合生物工程手段重组制备具有高效催化斯替维醇糖基化性能的该融合酶的方法，确定(GGGGS)subgt;2/subgt;多肽序列适宜于介导UGT91C1融合在UGT76G1的C末端，并利于中间产物直接转化为产品，而避免中间体向体相扩散。UGT91C1‑UGT76G1融合酶的基因序列为Seq ID NO.1，命名为ugt91C1‑ugt76G1，蛋白质一级序列为Seq IDNO.2。本发明还公开了ugt91C1‑ugt76G1基因合成、重组质粒构建、异源表达、纯化及催化性能表征的方法，所得UGT91C1‑UGT76G1催化级联反应的效率高，其制备更加集约经济，可以减少级联反应中间产物分离和纯化等单元操作，产生较少的废物，更加符合绿色化学合成理念，具有良好的工业催化转化应用前景。

技术领域

本发明涉及以底物导流原理为指导、通过计算机辅助的UGT91C1-UGT76G1融合酶分子设计以及在酵母中的重组制备方法，及其催化性能与应用，属于生物催化与生物转化领域。

背景技术

四环二萜类化合物在自然界植物体内广泛存在，在医药、化妆品、食品添加剂、工业高分子合成等领域也具有广泛的应用价值。斯替维醇苷(糖基化的斯替维醇)是四环二萜类化合物的重要代表，来自于甜叶菊，随着其糖基化结构的变化，其甜度可达到食用蔗糖的30-300倍。最重要的是，斯替维醇苷热值低、非醇解、热稳定性和生物相容性好，因此可用作高品位甜味剂，被誉为继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源。斯替维醇苷还有其它用途，包括药品敷料和矫味剂、高血压患者治疗、糖尿病治疗及橡胶合成等。随着绿色生物制造时代的到来，市场上对于斯替维醇苷的需求越来越多，对于斯替维醇苷的生物催化合成和开发研究也进入新高潮。

UGT91C1(UDP-glycosyltransferase 91C1；EC:2.4.1.-)和UGT76G1(UDP-glycosyltransferase 76G1；EC:2.4.1.-)是两种依赖于UDPG的糖基转移酶，它们具有不同的催化斯替维醇进行葡萄糖基化的功能：前者催化1,2-β-D糖苷键的形成，而后者催化1,3-β-D糖苷键的形成。UGT91C1和UGT76G1可以分别催化合成系列斯替维醇苷产品，两者联合催化级联反应可以制备多糖基化的斯替维醇产品，用作高品位的甜味剂。当前，已开发了一些基于UGT76G1及其突变体的单一酶催化应用方法，如专利“一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷M的方法”(专利号202110967784.5)，但是有关计算机辅助的UGT91C1和UGT76G1联合催化级联反应的分子设计，尤其是基于底物导流原理的UGT91C1-UGT76G1双功能融合酶的构建与制备，未见有专利和文献报道。UGT91C1-UGT76G1融合酶催化级联反应，可以减少中间产物分离和纯化，涉及较少的单元操作，使用较少的溶剂和较小的反应器体积，使用较短的循环时间，得到较高的收率和产生较少的废物，还可以推动反应平衡向生成产物方向移动，因此具有重要的工业生物催化应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高催化性能的UGT91C1-UGT76G1融合酶分子构建与重组制备的方法，该融合体系可以避免反应中间产物在反应体系中的扩散，而是通过GGGGS多肽连接序列的介导，直接进入下一步的催化转化，从而实现高效率生物催化合成多糖基化的斯替维醇产品。

为了实现上述目的，本发明涉及的主要实施步骤包括：

(1)基于导流级联反应原理，设计多肽连接序列，介导UGT91C1融合在UGT76G1的C端；

(2)通过计算机辅助设计，确定UGT91C1-UGT76G1融合酶的多肽连接序列为GGGGS；

(3)UGT91C1-UGT76G1融合酶基因及其表达质粒的构建；

(4)UGT91C1-UGT76G1融合酶在毕赤酵母中的重组表达及后序纯化；

(5)UGT91C1-UGT76G1融合酶催化转化性能的表征。