[发明专利]一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法

权利要求书

1.一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，包括以下步骤：

步骤1) 用抗人Anti-UKLK1抗原包微孔板，得到包被后的微孔板，人源Anti-UKLK1浓度为0.5μg/mL～2.5μg/mL，包被后的微孔板在4～8℃放置≥16小时；在放置后的微孔板中加入封闭液，并在37℃孵育2小时；

步骤2) 将UKLK1和待测样品加入抗体包被的微孔板中孵育结合，形成抗原-抗体复合物；

步骤3) 将抗体Anti-UKLK1(Labelled antibody)加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体复合物孵育结合，形成抗原-抗体-检测抗体复合物，UKLK1(Labelled UKLK1)检测抗体浓度为0.5μg/mL～4μg/mL；

步骤4）将Streptavidin-HRP标记的亲和素加入所述抗体包被的微孔板中与抗原-抗体-检测抗体复合物孵育结合，形成抗原-抗体-检测抗体-HRP标记的亲和素复合物，加入底物显色，Streptavidin-HRP标记的亲和素1:50～1:800，加入HRP酶的底物TMB显色时间5～20分钟；

步骤5) 加入终止液终止反应，测定OD值；

步骤6) 通过UKLK1标准曲线计算待测样品在血清中UKLK1浓度。

2.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤1）中人源Anti-UKLK1浓度为1μg/mL，所述封闭液为2%BSA-PBS溶液。

3.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤2）中，UKLK1抗体浓度为混合大鼠血清标准曲线范围，31.25pg/mL～8000pg/mL；质量控制样品范围为150pg/mL～4000pg/mL。

4.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤3）中，UKLK1(Labelled UKLK1)检测抗体浓度为2μg/mL。

5.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤4）中，Streptavidin-HRP标记的亲和素1:200，TMB底物显色时间5分钟。

6.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤5）中，加入终止液时间5分钟内，在450nm、参比波长620nm处用酶标仪测定吸光度值。

7.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤6）中，计算时，已知标准曲线，QC及血清样品中UKLK1浓度计算通过Microsoft Excel 2010软件获取UKLK1标准曲线浓度对数，然后通过SimaPlot10.0软件分别获取UKLK1标准曲线浓度对数作为X和Y轴制作标准曲线并进行Logistic四参数拟合，标准曲线拟合方程如下，

f=D + (A‐D)/(1+10^((x‐logC)*B))，(权重=1/y^2)

获得方程参数后计算生物样品中的浓度。

8.根据权利要求1所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：所述步骤2）—步骤4）在进行孵育结合时，于加入样品后，37℃孵育1小时。

9.根据权利要求8所述测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，其特征在于：样品稀释液为1%BSA/PBS/0.05% Tween-20。