[发明专利]一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法

说明书

本发明涉及一种测定血清中人源抗体的ELISA方法，属于生物医药技术领域。本发明针对人源抗原与UKLK1孵育结合，然后加入标记KLK1检测抗体，再加入SA‑HRP标记的亲和素加，形成抗原‑抗体‑检测抗体‑HRP标记的亲和素复合物，来提高血浆浓度测定灵敏度。并且通过方法学进行了论证。内容包括标准曲线，精密度和准曲度，稀释线性与钩状效应，基质效应与回收率，稳定性。其有益效果是：检测灵敏度高、误差小、特异性高，能够正确、有效地定量PK与TK抗体在血清中浓度，可以用于临床前PK与TK样品，也可以用于临床样品测定，缩短项目进程，尽早进入临床阶段，应用范围可扩大至人血清。

技术领域

本发明涉及一种测定血清中人源抗体的ELISA方法，尤其涉及一种测定血清中人源UKLK1的ELISA方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

人尿激肽原酶(U-KLK1)主要成分为激肽原酶，系从人尿中提取精制的一种由238个氨基酸组成的糖蛋白。激肽原酶(kiniogenase)又叫激肽释放酶(kallikrein),是激肽原酶-激肽系统(KKS)的一个组成成员。KKS在激肽乳动物中广泛存在，与体内多个信号系统有密切的联系。KKS系统的组成有以下几个部分: 激肽原、激肽原酶、激肽、激肽酶、激肽受体和激肽原酶抑制剂。激肽原在激肽原酶的作用下，释放出激肽。激肽通过与激肽受体结合，产生下泳的信号传导途径，发挥各种生理功能。激肽可被激肽酶降解。激肽原酶可被激肽酶制剂所抑制。

激肽原酶分为血浆激肽原酶(PK)和组织激肽原酶(TK)。血浆激肽原酶存在于血浆中。组织激肽原酶广泛存在于人体肝、肾、脑等器官和唾液、血浆、关节液、脑脊液等各种体液中。组织激肽原酶的分布比血浆激肽原酶广泛，主要在组织中合成。这一类激肽原酶在人体中已经发现15种，位于同一染色体上，但是只有组织型激肽原酶1（hK1）具有催化激肽原水解产生激肽的作用。其催化的活性位点组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸分别位于hK1编码基因的1、3、5外显子。人尿激肽原酶（尤瑞克林），实际上就是分泌到尿液的组织型激肽原酶1（hK1）。

hK1最早发现在肝中合成，其英文名kallikrein，就是取希腊文“肝”的词根而起的，即在肝里产生的蛋白酶。血浆中的hK1主要来自肾，其次是动脉平滑肌细胞和中性粒细胞，另外一些细胞也释放hK1。人尿里的激肽原酶有50%是有活性的，另50%是以酶原形式存在。一价或二价阳离子抑制人尿激肽原酶的活性。

hK1是酸性蛋白，pI约4.0，分子量24-45kD，长238AA，单链。肝与肾的组织激肽原酶1在162位具有多态性。唾液腺的组织激肽原酶1在121位和162位也具有多态性。KLK1蛋白产物具有三个天冬氨酸连接的N糖链和三个O糖链，糖基占20%。糖链上的唾液酸对该酶的热稳定性起到重要作用。hK1以前体的形式（preprokallikrein）产生，信号肽长17个AA。Preprokallikrein从细胞中分泌出来时，信号肽被切掉，成为酶原形式（prokallikrein）。从酶原形式到活性形式，prokallikrein要被切掉7个氨基酸。这个过程可能发生在细胞内的高尔基体或分泌泡内；也可能发生在细胞外，即分泌出细胞后，被激活的组织激肽原酶所激活，或被其它有胰酶特性的酶激活。血浆激肽原酶和纤溶酶都可激活hK1，但效率不高。因此，血浆中的hK1以三种形式存在：活性形式、酶原形式，还有一种形式是与α1-抗胰蛋白酶结合的复合体形式。

市场上尤瑞克林(uKLK1)用于轻-中度急性血栓性脑梗死的作用靶点是激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)。研究表明，在脑缺血急性期，KKS激活参与侧支小血管的迅速开放，改善缺血区血流灌注并抑制神经细胞的凋亡；在脑缺血恢复期，KKS激活对缺血区血管新生和神经元再生具有促进作用，KKS还可减少梗死后的细胞凋亡、减弱脑内的氧化应激反应、增加胶质细胞的存活和迁移。尤瑞克林是从尿液中提取出的一种组织性激肽释放酶(tissue kallikrein，TK)，它通过催化激肽原产生胰激肽、之后在激肽酶1的作用下产生一个九肽调节物，从而靶向性的作用于缺血部位的B1受体，选择性地扩张脑部细微动脉，改善缺血区的血供和氧供；同时还能促进缺血区新生血管的生成。