[发明专利]一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，以毕赤酵母为表达菌株，在表达菌株内构建有共表达编码人β-防御素基因hβD-2、硫氧还蛋白基因Trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因DscA和肠激酶基因rEK的质粒；其中，hβD-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Trxa的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，DscA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，rEK的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株，其特征在于，所述毕赤酵母为毕赤酵母P.pastoris GS115。

3.权利要求1所述高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建携带有编码人β-防御素基因hβD-2、编码硫氧还蛋白基因Trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因DscA和肠激酶基因rEK的表达载体；

2)以毕赤酵母为宿主，转化步骤1)得到的表达载体，获得人β-防御素的毕赤酵母工程菌株。

4.根据权利要求3所述高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于，以pPIC9K作为载体质粒，在表达载体pPIC9K上同时构建人β-防御素基因hβD-2、硫氧还蛋白基因Trxa、蛋白质二硫键异构酶基因DscA和肠激酶基因rEK的表达框；得到重组表达载体pPIC9K-hβD-2-T2A3-Trxa-T2A4-rEK，pPIC9K-hβD-2-T2A3-DscA-T2A4-rEK以毕赤酵母P.pastoris GS115作为宿主菌转化重组表达载体获得HBD-2的重组工程菌株。

5.权利要求1所述的毕赤酵母工程菌株在生产人β-防御素中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将毕赤酵母工程菌株活化后，转接到发酵培养基中20-35℃进行发酵培养，培养至OD_600nm为100-500，加入终浓度为0.1％-3％(V/V)的甲醇，诱导72h后离心收集发酵液上清。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：每升培养基中含26.7mL 85％H₃PO₄，0.93g CaSO₄·2H₂O，18.2g K₂SO₄，14.9g MgSO₄·2H₂O，4.13g KOH，20-60g甘油。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：每升培养基中含26.7mL 85％H₃PO₄，0.93g CaSO₄·2H₂O，18.2g K₂SO₄，14.9g MgSO₄·2H₂O，4.13g KOH，1-20mL甲醇。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养温度为30℃；甲醇的终浓度为0.5％。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，毕赤酵母培养周期为48-96h。