[发明专利]一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种高产HBD‑2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明以毕赤酵母为表达菌株，通过共表达编码人β‑防御素的基因hβD‑2、编码硫氧还蛋白的基因Trxa、编码蛋白质二硫键异构酶的基因DscA和肠激酶基因rEK，构建人β‑防御素2的合成途径，获得人β‑防御素2的积累菌株。本发明为人β‑防御素2的合成提供了新的策略，其生产效率比酶法切割重组防御素及化学法合成防御素明显提高，生产成本大大降低，为防御素的工业化大规模生产奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，随着抗生素的滥用导致多重耐药菌感染，已经成为临床医学中亟待解决的难题，而新的可用于临床使用的抗生素的挖掘进展缓慢。因此，开发新型的抗菌药物迫在眉睫。防御素是已知发现的内源性抗生素肽家族中最大的亚家族，普遍存在于动物、植物及人体内，分子结构相对稳定，且具有强力广谱抗菌、抗病毒、抗螺旋体及抗肿瘤等生物学活性。其中，人β-防御素2(human β-defensin-2，HBD-2)是一种小分子抗菌肽，是由41个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸残基，3对二硫键稳定其构型(三条反向平行的b-片层)的短肽。HBD-2表面带有较多正电荷，内部具有较多的疏水氨基酸组成疏水结构区，这样的结构使HBD-2具有亲水又亲脂的两亲性，能够在微生物细胞膜上形成孔道，破坏微生物细胞膜，达到杀菌和抑菌的作用。因此，HBD-2是具有重要应用前景的人源抗菌肽，可以应用于食品、医药、饲料等领域。但HBD-2在机体正常组织中水平很低，不适合通过分离纯化的方法在正常组织中获得具有生物活性的HBD-2。化学法合成HBD-2的价格相当昂贵，从而严重阻碍了HBD-2的大规模生产及其工业化应用。

鉴于HBD-2正确折叠需要形成3对二硫键，而微生物细胞自身形成二硫键的能力较弱，所以很难制备获得结构正确的HBD-2。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题在于提供一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株；本发明所要解决的第二技术问题在于提供上述高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法；本发明所要解决的第三技术问题在于提供所述的毕赤酵母工程菌株在一步发酵生产HBD-2中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株，以毕赤酵母为表达菌株，在表达菌株内构建有共表达编码人β-防御素基因hβD-2、硫氧还蛋白基因Trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因DscA和肠激酶基因rEK的质粒；其中，hβD-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，Trxa的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，DscA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，rEK的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述毕赤酵母为毕赤酵母P.pastoris GS 115。

所述高产HBD-2的毕赤酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)构建携带有编码人β-防御素基因hβD-2、编码硫氧还蛋白基因Trxa、蛋白质二硫键异构酶的基因DscA和肠激酶基因rEK的表达载体；

2)以毕赤酵母为宿主，转化步骤1)得到的表达载体，获得人β-防御素的毕赤酵母工程菌株。

所述的毕赤酵母工程菌株在生产人β-防御素中的应用。

所述的应用，将毕赤酵母工程菌株活化后，转接到发酵培养基中20-35℃进行发酵培养，培养至OD_600nm为100-500，加入终浓度为0.1％-3％(V/V)的甲醇，诱导72h后离心收集发酵液上清。