[发明专利]一种稳定同位素15

说明书

本发明涉及一种稳定同位素¹⁵N标记L‑异亮氨酸的制备方法，包括：选取适用于¹⁵N标记的L‑异亮氨酸发酵生产的菌种，菌种包括短杆菌属及棒杆菌属的变异株；配置培养基，对L‑异亮氨酸发酵生产的菌种进行发酵培养；将含有¹⁵N标记L‑异亮氨酸的发酵液经离心后采用离子交换法提取分离，得到¹⁵N标记的L‑异亮氨酸产品和其他少量L‑丙氨酸‑¹⁵N、L‑缬氨酸‑¹⁵N、L‑赖氨酸‑¹⁵N₂产品。与现有技术相比，本发明通过多添加生长因子等来改善发酵配方，促进微生物的生长和代谢，使同位素丰度得到控制，减少了丰度下降的风险，解决了¹⁵N的丰度下降问题；对提取分离采用氯化铵溶液梯度洗脱的精细化操作以提高产品得率并得到副产品，来共同提高稳定同位素¹⁵N的利用率。

技术领域

本发明涉及稳定同位素标记化合物的研究制备领域，尤其是涉及一种采用微生物发酵和后续分离提取法制备稳定同位素¹⁵N标记的L-异亮氨酸的方法。

背景技术

L-异亮氨酸是人体八大必需氨基酸之一，属于支链氨基酸，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中有特别重要的作用，在当今社会的应用越来越广泛，已被应用于医药、化妆品、食品和饲料等领域。而¹⁵N标记的L-异亮氨酸作为示踪剂被广泛用于生命科学、基因组学、蛋白质组学、代谢工程以及相关的氨基酸代谢机理研究等方面，有广阔的应用前景。

氨基酸的传统生产方法有提取法(蛋白质水解法)、有机合成法、酶法和发酵法等。从理论上说这些方法都可以用来制备稳定同位素标记的产品。但提取法常用于制备标记的复合氨基酸，如今由于受到原料限制已很少使用。采用有机合成法制备L-氨基酸若不是采用手性合成法得到的产品是DL消旋型的，还需要光学拆分才能得到L-型的产品，由于异亮氨酸具有2个不对称碳原子因而有4种旋光异构体而L型的产品只占了1/4，这就使¹⁵N稳定同位素的原料利用率大为降低，成本显著上升。酶法制备标记的L-氨基酸需要得到合适的稳定同位素标记的底物和可用的酶源，且标记底物又少又贵也不易得到。而微生物发酵法则在合适的氨基酸产生菌的存在下辅以良好的生产工艺便可得到稳定同位素标记的氨基酸，有一定的优越性。

同样对制备¹⁵N标记的L-异亮氨酸而言，采用微生物直接发酵的生产工艺是最绿色环保最优越的。微生物发酵法是工业上生产L-异亮氨酸的主要方法，关于发酵法生产L-异亮氨酸的研究报道很多，但在关于用生物合成法研究稳定同位素¹⁵N标记的L-异亮氨酸的生产领域中很少见有专利和文献报道。

由于种子、发酵配方中存在玉米浆等有机氮源，会稀释稳定同位素¹⁵N的丰度，如不加以优化控制，会使产品的同位素丰度大为降低而达不到产品的质量要求。

由于L-异亮氨酸是支链中性氨基酸，而发酵液中存在有不同的酸性、中性和碱性氨基酸，从分离的角度来说中性氨基酸是最难被分离出来的。L-异亮氨酸-¹⁵N发酵液中还存在同样是支链中性氨基酸的L-缬氨酸-¹⁵N，以及L-丙氨酸-¹⁵N等中性氨基酸、L-赖氨酸-¹⁵N₂等碱性氨基酸。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种既解决¹⁵N丰度下降问题、又提高了产品得率及同位素利用率并能同时获得副产的其他¹⁵N标记氨基酸的制备方法，本发明采用微生物发酵法制备L-异亮氨酸-¹⁵N，通过对发酵液进行提取分离得到产品，上游对发酵工艺进行优化以控制产品的丰度下降，下游需对分离提取精细化操作以提高产品得率，来共同提高稳定同位素¹⁵N的利用率。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：