[发明专利]一种检测γδT细胞受体多样性的方法

说明书

本发明提供了一种检测γδT细胞受体多样性的方法、γδT细胞受体多样性检测试剂盒、γδT细胞受体多样性检测的引物组合及其应用。采用本发明检测γδT细胞受体多样性的方法可以评估γδT细胞受体多样性，识别并量化体内免疫应答增殖克隆，从而评估免疫识别能力。

技术领域

本发明属于医学免疫学领域，涉及一种检测γδT细胞受体多样性的方法，从而评估免疫识别能力。

背景技术

淋巴细胞是免疫系统的基本成分，在体内分布广泛。T淋巴细胞(T cell)和B淋巴细胞(B cell)主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于T细胞受体(T cellrecptor,TCR)和B细胞受体(B cell recptor,BCR)，这两类细胞表面分子的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子，而免疫组库就是针对B/T淋巴细胞抗原受体多样性检测，即BCR/TCR的多样性。BCR和TCR一般由可变区(V区)、多变区(D区)、连接区(J区)、恒定区(C区)构成,V(D)J区域在遗传过程中发生重排或重组，形成大量不同的组合形式，导致BCR和TCR基因序列多样性极其丰富，这些序列多样性集合称为免疫组库。利用免疫组库检测技术对外周血中TCR的CDR3区域进行测序来判断TCR受体多样性，包括TRA、TRB、TRG、TRD基因的多样性，主要是CDR3区。

对于某种特定的疾病或抗原，免疫系统中的T淋巴细胞和B淋巴细胞会做出特异的免疫反应，以产生对抗抗原的特异性TCR和BCR基因序列。记忆性的免疫细胞将长期存在于免疫系统中，以便在抗原再次入侵时能够快速做出反应。因此，通过寻找特定疾病或抗原引起的免疫反应中所对应的特定TCR/BCR序列，分析它们在组合和数量上的变化，在癌症免疫治疗、抗体药物研发、疫苗评估、感染性疾病及自身免疫性疾病诊疗等领域有着巨大的研究和应用前景。

比如，克隆类型的多样性。一个人免疫克隆的多样性越多，那就可以抵抗的抗原种类就越多，也就说明他的免疫力相对就要好一些，反过来举一个极端的例子，另一个人只有一种克隆类型，那就意味着只能应对那一种抗原，而对其他的抗原则无法识别并产生免疫应答反应，所以克隆的多样性与免疫力之间是有着比较密切的关系的。评价克隆多样性的指标常用的有辛普森系数，基尼系数，D50值等。

T细胞主要分为αβT和γδT细胞两大类(根据T细胞受体不同)。αβT细胞一般表达CD4或CD8，对于抗原的识别依赖于抗原呈递细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子；而人的γδT细胞绝大多数为CD4、CD8双阴性细胞，极少数为CD8单阳性细胞，对抗原的识别也无需MHC分子的辅助，即无MHC限制性，是一群非经典的T细胞。在正常生理情况下，γδT细胞主要分布于皮肤、小肠、食道、肺以及生殖器官等上皮组织内，在外周血T淋巴细胞中仅占0.5％～5％。

γδT细胞在抗感染、抗肿瘤、免疫监视以及免疫耐受等方面具有重要的作用，活化的γδT细胞具备多种效应功能：γδT细胞不仅可通过释放穿孔素和颗粒酶、INF-γ、TNF-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6等分子发挥抗肿瘤作用，还可通过ADCC、Fas-Fas L、TRAIL-TRAILR等途径发挥其抗肿瘤效应，还可在自身免疫疾病、感染性疾病等中直接参与或调节机体免疫应答，在疾病的发生和宿主防御中扮演重要的角色。其中编码T细胞受体γ链对应的TRG基因所在染色体的位置及起始基因排列组成如图1所示。

发明内容

基于现有技术中的缺陷，本申请针对TRG的CDR3区域通过单端锚定PCR和巢式PCR构建测序文库进行测序，测序文库的构建，简化建库的操作过程，降低建库的时间和成本，同时不影响测序质量。

具体的，

第一方面，本发明提供了一种检测γδT细胞受体多样性的方法，所述的方法包括：针对TRG的CDR3区域通过单端锚定PCR和巢式PCR构建测序文库进行测序。

优选的，所述的方法具体步骤包括：

1)分离PBMC；