[发明专利]牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用及方法

权利要求书

1.一种牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用，其特征在于包括如下步骤：

步骤一、人肠上皮细胞Caco-2细胞的培养；

步骤二、肠上皮细胞热应激处理；

步骤三、牡荆素对热应激处理前后细胞存活率检验；

步骤四、牡荆素对肠上皮细胞热应激损伤的调控验证。

2.根据权利要求1所述的牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用，其特征在于：所述步骤一的具体方法：从液氮罐中取出冻存的人肠上皮细胞Caco-2细胞1mL，放入37℃水浴中复苏，用完全培养基进行培养，将细胞培养在37℃、5％CO₂的培养箱里培养，每隔一天更换培养液或进行传代，细胞长到对数生长期开始试验。

3.根据权利要求2所述的牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用，其特征在于：所述步骤二的具体方法包括如下步骤：

①用胰蛋白酶消化步骤一中长到对数生长期的人肠上皮细胞，细胞计数后，制成1x10⁴个/mL的细胞悬液，将细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，每孔接种100μL，接种2个细胞培养板，放置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

②待上述步骤中培养的细胞长到80％时，用含1％的胎牛血清的培养基饥饿处理2h，向两板中分别加入0μΜ、1μΜ、3μΜ、30μΜ、100μΜ的牡荆素于37℃、5％CO₂的培养箱中培养2h；

③将上述②中的两板细胞分为2组，1板放入43℃、5％CO₂培养箱中高温培养6h，引起热应激反应；另1板继续放在37℃、5％CO₂培养箱培养6h；热应激处理后将2个板放在37℃、5％CO₂培养箱继续培养6h。

4.根据权利要求3所述的牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用，其特征在于：所述步骤三的具体方法：向步骤2中的两个96孔板中加入15μLMTT溶液后在37℃、5％CO₂培养箱培养孵育3h，吸出培养液后加入100μLDMSO溶液，避光震荡20min；全波长酶标仪测定各孔在激发波长为490nm处的吸光度OD值，计算每组细胞存活率：

细胞存活率＝试验组OD值/对照组OD值×100％

对照组为未加牡荆素的组，细胞存活率设定为100％。

5.根据权利要求4所述的牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用，其特征在于：所述步骤四的具体方法包括如下步骤：

(1)按步骤3测出的细胞存活率结果，选择浓度为30μM的牡荆素进行后续实验，用胰蛋白酶消化步骤1中对数期的细胞，加入新的培养液重悬，加入6孔板中，使最终细胞密度为1×10⁵/孔，摇匀后放入37℃、5％CO₂培养箱中培养24h，建立以下4组试验：

a.对照组37℃，将细胞板放置于37℃条件下正常培养6h；

b.模型组43℃，将细胞板放置于43℃条件下正常培养6h；

c.给药组37℃+牡荆素，向细胞中加入牡荆素，置于37℃条件下正常培养6h；

d.热应激给药组43℃+牡荆素，向细胞中加入牡荆素，置于43℃条件下正常培养6h；

(2)测定对照组、模型组、给药组、热应激给药组的细胞中ROS、MAD、SOD、GSH-Px的含量；

(3)采用流式细胞术检测对照组、模型组、给药组、热应激给药组的细胞凋亡情况；

(4)采用蛋白免疫印迹法检测对照组、模型组、给药组、热应激给药组的HSP70、HSP90、Bcl-2和Bax的凋亡蛋白表达情况。

6.根据权利要求5所述的牡荆素缓解人肠上皮细胞热应激损伤的应用，其特征在于：完全培养基DMEM细胞培养基中加入20％体积分数的胎牛血清和1％的青霉素-链霉素溶液。