[发明专利]一种噬菌体展示筛选CD32a单链抗体及制备方法和应用

说明书

本发明提出了一种噬菌体展示筛选CD32a单链抗体及制备方法和应用，所述CD32a单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的CD32a单链抗体可以作为靶点连接到CAR‑T，用于构建靶向HIV的临床治疗药物。

技术领域

本发明涉及噬菌体展示技术领域，尤其涉及一种噬菌体展示筛选CD32a单链抗体及制备方法和应用。

背景技术

噬菌体展示是一种非常有效能生产大量不同肽和蛋白质，并分离得到特定功能的分子，这项技术也可以用来研究蛋白质与配体之间的相互作用。常用的噬菌体展示技术如M13噬菌体展示可以观察到编码数百万个配体变体的DNA批量克隆到噬菌体载体或病毒基因组中，从而与编码噬菌体外壳蛋白的基因融合。融合产物的表达及其与噬菌体外壳的结合呈现病毒表面的配体，而融合的编码序列驻留在噬菌体颗粒内。展示使带有相关配体的病毒能够结合到感兴趣的固定靶标上，而非粘附性噬菌体可以被洗掉。整个过程需要噬菌体上大容量库的合成，噬菌体上配体展示的成功富集，有效的展示策略对于最大限度利用噬菌体库的多样性是至关重要的。

潜伏感染HIV的CD4+细胞在接受治疗的情况下表达很低的病毒抗原，使得免疫系统和针对HIV gp120靶点的CAR免疫细胞无法识别，且HIV并不均匀的分布于T细胞亚群中，因此无法彻底清除HIV。CD32a作为HIV潜伏库的标志物早在2017年被法国科学家提出，低亲和力的IgG Fc片段受体CD32a(也称为FcγRIIA)被认为是HIV潜伏期的标志物。

CN 110714019A公开了一种新型的人源Fab噬菌体展示载体，未公开CD32a噬菌体展示。本发明公开了一种以CD32a抗原为靶点免疫兔得到的单链抗体ScFv，连接载体利用噬菌体展示技术筛选出来的抗体序列，以CD32a为靶点的抗体序列有望连接到CAR-T上用于构建能靶向HIV的临床治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种噬菌体展示筛选CD32a单链抗体及制备方法和应用，其中CD32a单链抗体可以作为靶点连接到CAR-T，用于构建靶向HIV的临床治疗药物。

本发明的技术方案是这样实现的：第一，本发明提供了一种噬菌体展示筛选CD32a单链抗体，所述CD32a单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述CD32a单链抗体包括轻链区和重链区，所述轻链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3。

第二，本发明提供了一种噬菌体展示筛选CD32a单链抗体的制备方法，包括如下步骤：

S1，对兔抗人CD32a抗体轻链区序列进行扩增，对兔抗人CD32a抗体重链区序列进行扩增；

S2，将兔抗人CD32a抗体轻链区序列、对兔抗人CD32a抗体重链区序列通过overlap的方式连接起来，得到SCFV单链抗体序列；

S3，pMED1载体酶切；

S4，酶切后的pMED1载体与步骤S2的SCFV单链抗体序列连接，然后经过电转和多轮筛选得到高亲和力的抗体序列。

在以上技术方案的基础上，优选的，采用sfil酶对pMED1载体进行酶切。

在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S1中轻链区序列扩增的引物为Sfil-VL1和Sfil-VL2中任一引物与VL-b4J2-linker和VL-b9J2-linker中任一引物的组合；其中Sfil-VL1引物如SEQ ID NO.4所示；Sfil-VL2引物如SEQ ID NO.5所示；VL-b4J2-linker引物如SEQ ID NO.6所示；VL-b9J2-linker引物如SEQ ID NO.7所示。