[发明专利]一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株及其构建方法

权利要求书

1.一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，其特征在于，所述莱茵衣藻为敲除了莱茵衣藻出发株中SRTA基因后得到的突变藻株。

2.根据权利要求1所述的一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，其特征在于，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻出发株的SRTA基因被错义替换为包含三个终止密码子的核苷酸序列，该序列为：

5’-TGACGCTAGGGCTGAGCCTCGA-3’。

3.根据权利要求1或2所述的一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，其特征在于，所述莱茵衣藻出发株为任何SRTA可正常表达的莱茵衣藻藻株。

4.根据权利要求3所述的一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，其特征在于，所述莱茵衣藻出发株为野生型莱茵衣藻藻株、莱茵衣藻突变株或莱茵衣藻转基因工程藻株。

5.权利要求1-4任一项所述的一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、制备靶向莱茵衣藻SRTA基因的gRNA，所述gRNA由如下引物进行PCR扩增得到：

gRNA-F：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAAGCGCGTGTTCGTCTTT

ACGTTTTAGAGCTAGAA-3’；

gRNA-R：5’-AAAAAAGCACCGACTCGGTG-3’；

S2、体外组装gRNA/cas9复合体；

S3、制备修复莱茵衣藻双链的供体片段，供体片段由两条单链互补配对形成，其中一条单链上具有一段核苷酸序列，在该序列两端分别连接包含30-40个碱基的同源臂；该核苷酸序列为：

5’-TGACGCTAGGGCTGAGCCTCGA-3’；

S4、电转化

将准备好的莱茵衣藻出发株细胞进行热激处理，将莱茵衣藻出发株细胞与gRNA/cas9复合体、供体片段以及抗性片段充分混合，电击导入，之后采用含抗生素的培养基进行抗性筛选，选出长出藻落的藻株，进行PCR鉴定，选出转化子。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，所述供体片段是由如下单链经退火形成的双链：

donor-F：

5’-GCCGCTACTGCTGCAGGTCCGCGACGCCAAGCGCG

TGTGACGCTAGGGCTGAGCCTCGATCTCCACCGCCTGC

GGCATCCCTGACTTTCG-3’；

donor-R：

5’-CGAAAGTCAGGGATGCCGCAGGCGGTGGAGATCG

AGGCTCAGCCCTAGCGTCACACGCGCTTGGCGTCGCGG

ACCTGCAGCAGTAGCGGC-3’。

7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S4中，所述抗性片段为巴龙霉素抗性片段或潮霉素抗性片段；所述抗生素为巴龙霉素或潮霉素。

8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S3中，退火是在annealingBuffer核苷酸退火缓冲液存在条件下进行的，annealing Buffer核苷酸退火缓冲液含有100mM Tris-HCl，pH8.0和500mM CH3COOK，10mM EDTA。

9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤S4中，每5ⅹ10⁵cells添加4-6μL的gRNA/cas9复合体；所述gRNA/cas9复合体的组装方法如下：

在超净台内用无RNA污染的枪头和管子按照下述加样量加样，于37℃孵育10-15min或常温孵育30min；加样量为：

gRNA 7.5-75μg、Cas9蛋白25-50μg、10×reaction Buffer 2-3μL，ddH2O补足到20-30μL；

电击参数为：Bio-RAD电穿孔仪，参数：电压600V，电容50μF，电阻∞，杯子：4mm；

电击后迅速向电击杯中加入TAP-Suc并轻柔混匀。