[发明专利]一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株及其构建方法

说明书

本发明提供一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，该突变株为敲除了莱茵衣藻出发株中SRTA基因后得到的突变藻株，具体是将莱茵衣藻出发株的SRTA基因被替换为包含三个终止密码子的核苷酸序列，为：5’‑TGACGCTAGGGCTGAGCCTCGA‑3’。该莱茵衣藻出发株可为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)野生型、突变藻或转基因工程株。此外，本发明还提供一种稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株的构建方法。该莱茵衣藻突变株可高表达外源基因，传代稳定性高，具有较长纤毛，能与其他藻种杂交，培养时其生长速度与出发株相当，是一种提供外源蛋白的表达的优良底盘藻株。

技术领域

本发明涉及微藻基因工程领域，尤其涉及一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株及其构建方法。

背景技术

莱茵衣藻是单细胞植物，是分子生物学研究的模式生物之一。莱茵衣藻表达系统具有诸多优势。在法规方面，莱茵衣藻属于安全级微藻，经进入我国的食品名录，作为一种淡水微藻，它同时能够作为鱼、虾、蟹等水生动物的饵料；在培养工艺方面，莱茵衣藻光合效率高于高等植物，可以根据应用需求选择自养、异养或兼养的培养模式，培养规模可以根据需求调整。莱茵衣藻生长速度快、培养方式简单、培养基材料来源广，廉价易得，成本低。在分子生物学方面，莱茵衣藻基因组测序已经完成，遗传背景清晰，遗传转化操作成熟。

随着分子生物学技术的发展，转基因技术逐渐被应用到医药、农业等多个领域，转基因技术的重点在于外源基因在底盘细胞中的表达。已有多个文献报道，利用莱茵衣藻细胞核表达外源蛋白。但是，莱茵衣藻基因表达调控机制尤其是外源基因的沉默机制还没有完全被研究清楚。外源基因在莱茵衣藻中的表达水平常常较低且遗传不稳定(无法稳定高表达外源基因)，常出现基因沉默或传代后丢失的现象。

已有正向遗传学研究报道，莱茵衣藻中的表观组蛋白去乙酰化酶SRTA通过表观修饰抑制外源基因的表达，因此可通过敲除SRTA提高外源基因在底盘细胞中的表达。然而，已有的SRTA突变藻株存在多个问题：无鞭毛，不能与其他藻种杂交；生长速度慢，生产成本高；存在细胞壁缺陷，不耐剪切力，难以进行下游放大培养(如高密度发酵罐异养培养)。此外，Crispr/cas9技术出现后，衣藻的定点基因编辑也成为可能。但是由于衣藻的GC含量较高(62％)，而Cas9蛋白识别的PAM中富含GC序列，因此容易造成Cas9蛋白的脱靶，并且对衣藻具有潜在的毒性。衣藻DNA双链断裂主要依赖非同源重组修复，同源重组修复效率较低，因此供体片段的设计不能依照目前已成熟的方法设计得到。

综上所述，现有的SRTA突变藻株存在诸多不足，而对莱茵衣藻中SRTA实施精准敲除时也存在较大的执行困难。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，该藻株是通过Crispr/cas9基因编辑技术改造莱茵衣藻藻株，并提供含有终止子DNA的片段的供体序列用于双链的修复，终止SRTA的翻译，通过抗性筛选得到的转基因藻株。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一株稳定高表达外源基因的莱茵衣藻突变株，为敲除了莱茵衣藻出发株中SRTA(Cre10.g462200)基因后得到的突变藻株。

优选地，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻出发株的SRTA基因被错义替换为包含三个终止密码子的核苷酸序列，该序列为：

5’-TGACGCTAGGGCTGAGCCTCGA-3’。

优选地，所述莱茵衣藻出发株为任何SRTA可正常表达的藻株，包括但不限于野生型莱茵衣藻藻株、莱茵衣藻突变株(人工诱变或自然突变)或莱茵衣藻转基因工程藻株。