[发明专利]花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用

说明书

本发明公开了一种花生U6启动子及其在花生CRISPR‑Cas9基因编辑中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明的花生U6启动子为AhA3U6或AhB9U6，核酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。将启动子AhA3U6和AhB9U6替换pBGK041‑GmU6载体中的GmU6启动子，对花生PEPC1基因进行基因编辑，结果表明，采用含有花生U6启动子的基因编辑载体的编辑效率显著高于GmU6启动子，且AhA3U6优于AhB9U6，因此，采用AhA3U6启动子为进一步提高花生的编辑效率，构建花生高效基因编辑系统奠定基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9编辑系统是目前使用最广泛的基因编辑工具，利用该系统可以实现对目标基因的定点编辑，进而改变相关表型性状。运用该技术目前已经在水稻、小麦、玉米三大作物上实现了高效精确的单碱基定点突变，并显著提高了水稻白叶枯病抗性等相应表型性状。利用该技术首先需要构建有效的编辑载体，载体中含有根据靶基因序列设计的sgRNA(guide RNA)以及Cas9蛋白编码序列，Cas9蛋白在sgRNA的引导下可实现对目的基因的精确修饰，因此sgRNA(guide RNA)的转录水平以及Cas9蛋白的翻译水平直接影响到靶基因的编辑效率。

目前针对单子叶植物的编辑载体主要使用OsU3、AtU6、ZmU6等启动子来驱动sgRNA的转录，而双子叶植物则主要使用AtU3、GmU6等启动子驱动sgRNA的转录。将目前含有常用启动子如OsU3、GmU6等编辑载体转入其它异源受体植物，在受体物种中外源启动子驱动的sgRNA的转录水平可能会受到一定程度的抑制，并进一步影响到靶基因的编辑效率。因而针对于特定的受体物种，选择高效率的启动子并设计包含该启动子的编辑载体，是提高受体物种编辑效率的有效手段。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生U6启动子及其在花生CRISPR-Cas9基因编辑中的应用。

一种花生U6启动子，所述花生U6启动子为AhA3U6或AhB9U6，所述启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

核酸序列如SEQ ID NO:1所示的启动子AhA3U6或核酸序列如SEQ ID NO:2所示的启动子AhB9U6在提高花生CRISPR-Cas9基因编辑效率中的应用。

一种花生CRISPR-Cas9基因编辑载体，所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中的启动子为AhA3U6或AhB9U6，所述启动子AhA3U6的核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述启动子AhB9U6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在一个具体的实施例中，所述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体是将pBGK041-GmU6载体中的GmU6启动子替换为AhA3U6或AhB9U6获得。

上述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体在花生基因编辑中的应用。

一种花生CRISPR-Cas9基因编辑的方法，步骤如下：

将目标基因靶位点的核酸序列构建到上述花生CRISPR-Cas9基因编辑载体中，获得CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒；将CRISPR-Cas9基因编辑重组质粒转化到农杆菌中，制备侵染液，侵染花生，筛选阳性转化株，实现花生目标基因的CRISPR-Cas9基因编辑。

在一个具体的实施例中，所述农杆菌侵染花生的方法为发根农杆菌转化法或花粉管通道转化法。

在一个具体的实施例中，所述发根农杆菌转化法中采用的农杆菌为发根农杆菌，所述花粉管通道转化法中采用的农杆菌为根癌农杆菌。