[发明专利]一种代谢工程改造酿酒酵母从头合成δ-生育三烯醇的方法

说明书

本发明公开了一种代谢工程改造酿酒酵母从头合成δ‑生育三烯醇的方法，本发明在酿酒酵母中构建并优化了δ‑生育三烯酚合成途径，再通过构建底物传输通道并过表达转运体PDR11，获得了胞外分泌高效生产δ‑生育三烯酚的基因工程菌株，为代谢工程改造酿酒酵母从头合成特定构型的天然维生素E奠定了基础。本发明提供的底物传输通道的构建方法简单有效，可解决多种外源酶组装不当导致的催化效率低问题。

技术领域

本发明涉及一种代谢工程改造酿酒酵母从头合成δ-生育三烯醇的方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术

δ-生育三烯醇，作为维生素E中的一个同分异构体，除了具有抗氧化作用，还因具有对人类健康更丰富的生物活性，特别是抗癌活性而受到关注。维生素E是生育酚和生育三烯酚的总称，包括α、β、γ、δ-生育酚和α、β、γ、δ-生育三烯酚这8种化合物，作为最主要的抗氧化剂之一，是维持机体代谢的必需维生素，功效广泛，市场需求量日益增长。虽然自1938年已经实现了化学法全合成维生素E，主要利用2,3,5-三甲基氢醌(主环)和异植物醇(支链)两种中间体以“一步缩合法”合成，当前技术较为成熟，但由于其无法合成特定立体构型的维生素单体从而影响维生素E的活性，而被广泛用于动物饲料添加剂。2018年国内实现了将生物与化学法结合来合成维生素E，但仅能利用微生物发酵法合成异植物醇(C₂₀H₄₀)的前体物质法尼烯(C₁₅H₂₄)，合成过程仍较复杂且主要依赖于化学合成。目前在保健、医疗、美容等方面，人们更趋向于选择天然合成的维生素E。现有的天然维生素E仍主要依赖植物提取，受限于植物资源的有限性和成本过高。因此利用基因工程法在微生物中人为地构建维生素E的生物合成途径来实现特定构型的天然维生素E从头合成是一种更方便、更经济的方式。

作为GRAS(Generally Regard as Safe)菌株，酿酒酵母已被广泛用于萜类和芳香族化合物等天然产物的生物合成。相比大肠杆菌，酿酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，受噬菌体污染的概率较低等优点，此外，酿酒酵母对几种异戊二烯类化合物，如法尼基二磷酸(FPP)和牻牛儿基二磷酸盐(GGPP)的耐受性高于大肠杆菌，更适合用于高水平生产异戊二烯类化合物的底盘细胞。由于GGPP是δ-生育三烯酚生物合成途径中的关键前体之一，因此酿酒酵母是更有利于δ-生育三烯酚生产的宿主菌株。酿酒酵母中不具有δ-生育三烯酚合成途径，所以需要利用代谢工程将δ-生育三烯酚合成途径引入酿酒酵母中，构建δ-生育三烯酚生产工程菌株。近年来，已有学者将光合作用生物的δ-生育三烯酚合成途径引入到酿酒酵母中，实现了δ-生育三烯酚在酿酒酵母中的从头合成。

目前，虽已经实现了δ-生育三烯酚在酿酒酵母中的从头合成，但将光合作用生物来源的基因导入酿酒酵母后，其表达、定位和组装模式存在不确定性，进而会引起一系列问题：异源酶的错误定位导致酶与底物分隔，合成产物所需前体被内源竞争性途径消耗，上下游酶之间的表达不平衡以及多种外源酶的组装不当导致的难以实现协同催化作用等。这些问题极大地限制了外源基因在细胞工厂中的功能性，从而导致δ-生育三烯酚生物合成效率低。

发明内容

为了解决目前δ-生育三烯酚生物合成效率低的问题，本发明提供一种高效合成δ-生育三烯酚的酿酒酵母菌，通过整合来自光合作用生物来源的δ-生育三烯酚合成通路，强化前体途径，突变δ-生育三烯酚合成模块中的关键酶，并构建底物传输通道对δ-生育三烯酚合成模块中的关键酶进行组装，以及过表达转运体PDR11，使得酿酒酵母可以胞外高效分泌生产δ-生育三烯酚。

本发明的第一个目的是提供一种代谢工程改造酿酒酵母从头合成δ-生育三烯醇的方法，所述方法是在酿酒酵母基因组上整合对羟基苯丙酮酸双加氧酶HPPD、尿黑酸牻牛儿基牻牛儿基转移酶HGGT和截短后的生育酚环化酶tTC，并过表达GGPP合成酶CrtE和FPP合成酶突变体FPS^F112A。