[发明专利]一种植物原生质体的分离与纯化方法

权利要求书

1.一种植物原生质体的分离与纯化方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一：解离材料的选择，所述解离材料为植物组织；

步骤二：将所述植物组织切成碎片，迅速移至酶解液中；

步骤三：将所述酶解液孵育，持续或间隔晃动帮助细胞释放；

步骤四：所述孵育结束后，加入W5溶液终止消化，得到混合液，将所述混合液进行过滤，收集滤液，对所述滤液离心，去除上清液，缓慢加入W5溶液重悬原生质体，以获得高质量的原生质体细胞，

其特征在于，所述酶解液成分包含蜗牛酶。

2.根据权利要求1所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述W5溶液成分包含铝盐、钙盐、柠檬酸盐中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液包含甘露醇、氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、氯化钾、蜗牛酶、纤维素酶R-10、离析酶R-10、牛血清蛋白、β-巯基乙醇，所述W5溶液成分为氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、氯化钾、蔗糖中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述离析酶R-10替换为果胶酶。

5.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述步骤四还包含将所述重悬原生质体过细胞筛，然后离心，去除上清，加入适量W5重悬。

6.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液成分的配比为0.1-1.6M甘露醇，1-20mM氯化钙，20-160μM氯化铝，10-40mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，1-40mM氯化钾，0.1-2.0％(w/v)蜗牛酶，0.5-3％(w/v)纤维素酶R-10，0.1-0.8％(w/v)离析酶R-10，0.01-0.2％(w/v)牛血清蛋白，1-1000mMβ-巯基乙醇，所述W5溶液的浓度配比为60-250mM氯化钙，20-160μM氯化铝，0.1‰-0.6‰(w/v)2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，2-10mM氯化钾，2-10mM蔗糖。

7.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液成分的配比为0.4-0.8M甘露醇，2-10mM氯化钙，40-80μM氯化铝，15-30mM2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，15-30mM氯化钾，0.5-1.0％(w/v)蜗牛酶，1-1.5％(w/v)纤维素酶R-10，0.2-0.4％(w/v)离析酶R-10，0.05-0.15％(w/v)牛血清蛋白，5-500mM的β-巯基乙醇，所述W5溶液配比为60-125mM氯化钙，40-80μM氯化铝，0.2‰-0.4‰(w/v)的2-(N-吗啉代)乙烷磺酸，4-6mM氯化钾，4-6mM蔗糖。

8.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述植物组织为花或芽或根或叶片。

9.根据权利要求2所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法，其特征在于，所述酶解液和所述W5溶液用尼龙滤膜过滤除菌。

10.一种用于分离与纯化植物原生质体的试剂盒，其特征在于，使用权利要求1-9所述的一种植物原生质体的分离与纯化方法。