[发明专利]一种植物原生质体的分离与纯化方法

说明书

本发明涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，包括以下步骤：步骤一：解离材料的选择；步骤二：将植物组织切成碎片，迅速移至酶解液中；步骤三：将酶解液孵育，持续或间隔晃动；步骤四：孵育结束后，加入W5溶液终止消化，得到混合液，将混合液进行过滤，收集滤液，对滤液离心，去除上清液，缓慢加入W5溶液重悬原生质体，以获得高质量的原生质体细胞，酶解液成分包含蜗牛酶，W5溶液成分包含铝盐、钙盐、柠檬酸盐中的一种或多种。

技术领域

本发明涉及一种植物原生质体的分离与纯化方法，更具体地说，涉及一种可用于不同植物的不同组织的原生质体分离与纯化方法。

背景技术

原生质体是去除细胞壁的植物细胞，可用于构建瞬时表达系统，用于蛋白亚细胞定位、蛋白相互作用、基因表达调控、亚细胞器制备以及悬浮细胞培养等研究方面得到了广泛应用；此外，近年来在动物细胞领域广泛应用的单细胞测序技术也开始应用于植物领域，该技术在植物领域应用的技术瓶颈之一就是原生质体的制备。受原生质体制备技术的限制，目前仅有少量模式植物可进行单细胞测序。由于细胞壁木质素含量高等原因，木本植物叶片原生质体分离难、完整性差。特别的，一些次生代谢物较多的物种，如茶树(Camelliasinensis L.)等，其富含多种特有天然化合物且缺少成熟的遗传转化体系，使其分子和细胞等基础研究无法在植物体内进行功能验证。因此，本发明提供的一种植物原生质体的分离与纯化方法对非模式植物的原生质体的制备的基础研究和生产应用都有重要意义。

现有报道的植物原生质体解离和纯化方法，往往受取材限制，特别在木本植物中，受到如花、种子苗和特殊品种限制。这难以满足研究人员的实验需求。特别在茶中，不同茶树品种的芽叶以及花都是重要的研究对象，然而茶树叶片蜡质厚、多酚含量高，原生质体难以分离，能够突破材料限制的原生质体制备方法有着巨大的应用前景。

发明内容

本发明针对现有的植物原生质体分离难、耗时长、完整性差及花瓣和种子苗原生质体提取具时效性等问题，旨在提供一种适于广泛解离对象的原生质体的快速分离和纯化方法，本方法能够适用于不同种类的植物，本方法特别是适用于解离难度高的木本植物，尤其是适用于茶、海桐(Pittosporum tobira)、栀子花(Gardenia jasminoides)、麦冬(Ophiopogon japonicus)等植物，本方法尤其是能够以植物的花、芽以及成熟叶为对象获得高质量的原生质体。

附图说明

图1为显微镜下本发明方法所制备的茶树叶的原生质体。

图2为显微镜下本发明方法所制备的茶树花的原生质体。

图3为显微镜下本发明方法所制备的麦冬叶的原生质体。

图4为显微镜下本发明方法所制备的海桐叶的原生质体。

图5为显微镜下本发明方法所制备的栀子花叶的原生质体。

具体实施方式

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种植物原生质体的分离与纯化方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一：解离材料的选择，所述解离材料为植物组织；步骤二：将所述植物组织切成碎片，优选切成2-10mm宽的长条，迅速移至酶解液中；步骤三：将所述酶解液孵育，持续或间隔晃动帮助细胞释放；步骤四：所述孵育结束后，加入W5溶液终止消化，得到混合液，将所述混合液进行过滤，收集滤液，对所述滤液离心，去除上清液，缓慢加入W5溶液重悬原生质体，以获得高质量的原生质体细胞。酶解液成分可以包含蜗牛酶。W5溶液成分可以包含铝盐。

酶解液包含甘露醇、氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(pH6.0)、氯化钾、蜗牛酶、纤维素酶R-10、离析酶R-10、牛血清蛋白、β-巯基乙醇，所述W5溶液成分为氯化钙、氯化铝、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、氯化钾、蔗糖中的一种或多种。所述甘露醇也可以用其他平衡剂替代，所述离析酶R-10可以用果胶酶替代。