[发明专利]一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种多聚磷酸盐依赖型激酶(PPGMK)的突变体蛋白，其通过理性设计和定点突变改造获得，具有较高的热稳定性和酶活力，其酶活力与原始多聚磷酸盐依赖型激酶PPGMK相比提高了1.06倍，热稳定性(半衰期)提高7.18倍；将该PPGMK的突变体蛋白应用于催化甘露糖合成甘露糖‑6‑磷酸可以提升生产效率和降低酶的损耗；本发明以PPGMK突变体蛋白为催化剂，酶法催化合成甘露糖‑6‑磷酸，提高了甘露糖‑6‑磷酸的产量。

技术领域

本发明属于基因重组技术领域，涉及一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术

甘露糖-6-磷酸(M6P)的分子式为C₆H₁₃O₉P，在人体细胞内参与了很多代谢途径，如糖异生、脂肪细胞的分化等。分泌蛋白在内质网折叠后，运送到高尔基体中，在最终糖基化修饰蛋白时，M6P参与末端修饰和糖蛋白标记；也可以参与细胞内溶酶体酶的标记，正因如此，它与人体的一些疾病有着间接关系。最近的文献报道提出甘露糖-6-磷酸与胰腺炎的发病有关，M6P通路可以维持胰腺外分泌平衡和功能，而M6P通路的阻断会导致溶酶体自噬途径的紊乱，进而导致胰腺炎的发病。

M6P作为一种与生物体内环境密切相关的物质，可以利用其参与反应的多样性，对M6P的应用进行开发，如磷酸甘露糖异构酶(PMI)作为一种可以催化M6P异构为果糖-6-磷酸(F6P)的酶，可以作为筛选体系正筛选植物转化细胞是否成功。在医疗应用上，目前人们已经利用M6P可以标记溶酶体酶的特征来进行靶向药物输送来治疗肿瘤。M6P与甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)的特异性结合对细胞信号传导的影响可以被用在很多疾病的治疗上，比如肿瘤、水痘和带状疱疹病毒、粘多糖病等等。M6P也可以与胰岛素生长因子II受体(IGF2R)结合，应用在畜牧业中治疗猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)，也可以应用在免疫化疗中。M6PR已经被证明与很多肿瘤细胞都有关，根据此原理可以利用甘露糖对肿瘤进行治疗。近年来M6P在美容领域也受到了重视，如改善皮肤的生物力学性能，从而达到抗衰老的目的及治疗皮肤发红等。如今对甘露糖-6-磷酸的应用研究仍是热点，它在生物体内参与的众多过程，更是使它在医疗上的应用十分广泛。

通过化学法合成M6P是低效且复杂的，传统生产工艺要先通过费歇尔糖苷化、再通过一系列的酯化反应、水解、浓缩、柱层析，最后用Swern氧化反应以及苄基保护反应，才能达到70％左右的收率。本课题组已经用来源于节杆菌(Arthrobacter.sp)KM菌株的L7基因(GeneBank登录号AB096174)异源表达了一种多聚磷酸盐依赖型激酶(PPGMK)，用六偏磷酸钠来代替价格高昂的ATP，低价绿色高效地合成M6P，在该研究中，12h反应后，甘露糖转化为M6P的转化率接近100％，反应在30℃下进行，无副产物，是一种绿色的生产工艺。但由于PPGMK的热稳定性很低，在50℃下40min就会失活，因此，目前亟需提高PPGMK的热稳定性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的问题，提供一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白，比野生型多聚磷酸盐依赖型激酶有着更高的热稳定性和酶活力。

为此，本发明第一方面提供了一种影响多聚磷酸盐依赖型激酶的热稳定性和酶活力的氨基酸突变子，其包括位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(PPGMK)的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第187位Ala突变为Arg和/或第166位Asn突变为Ser。

本发明第二方面提供了一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白，其序列包含位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(PPGMK)的如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列从N端到C端的第187位Ala突变为Arg和/或第166位Asn突变为Ser。