[发明专利]基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法

权利要求书

1.基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，包括如下操作：

步骤1：取苹果叶片作为外植体；

步骤2：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，得侵染叶片；

步骤3：将所述侵染叶片置于共培养培养基和选择培养基中，进行生根培养，得不定根；

步骤4：将所述不定根置于含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，进行生芽培养，得再生芽。

2.根据权利要求1所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，所述吲哚-3-乙酸的浓度为0.01-0.2mg/mL，所述噻苯隆浓度为1-3mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，所述吲哚-3-乙酸浓度为0.2mg/mL，所述噻苯隆浓度为2mg/mL。

4.根据权利要求1所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述步骤3的具体操作为：

将所述侵染叶片吸干水分后，叶背朝下置于共培养培养基中，24-26℃黑暗培养3天；

接着，叶腹朝下置于选择培养基中，24-26℃黑暗培养17-18天；

然后，置于选择培养基中，24-26℃黑暗培养40-42天，得所述不定根。

5.根据权利要求1或4所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述共培养培养基中含有以下成分：1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。

6.根据权利要求1或4所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，获得所述选择培养基的具体操作为：

将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，倒板，得所述选择培养基。

7.根据权利要求1所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作为：

将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，加入乙酰丁香酮，混合侵染后，用悬浮液洗，得所述侵染叶片；

所述悬浮液包括以下浓度的物质：1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖。

8.根据权利要求1或7所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，获得所述含有转基因质粒的发根农杆菌菌液的具体操作为：

取农杆菌菌株置于液体培养基中，28℃摇菌12h，得菌液；

将所述菌液加入液体培养基中，摇菌5h至OD600＝0.6，5000rpm离心5min，得菌块；

将所述菌块用悬浮液重悬，得发根农杆菌菌液；

将所述转基因质粒加入发根农杆菌菌液中，得所述含有转基因质粒的发根农杆菌菌液。

9.根据权利要求1所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述步骤4的具体操作为：

将所述不定根置于根生芽培养基中，控制温度为24-26℃，光周期为8h或16h，光照强度为2000lux，期间需每隔10天继代一次，继代4次后，得所述再生芽。

10.根据权利要求1所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，其特征在于，所述苹果叶片为苹果无菌组培苗顶端的叶片。