[发明专利]基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法

说明书

基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，包括如下操作：步骤1：取苹果叶片作为外植体；步骤2：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，得侵染叶片；步骤3：将所述侵染叶片置于共培养培养基和选择培养基中，进行生根培养，得不定根；步骤4：将所述不定根置于含有吲哚‑3‑乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，进行生芽培养，得再生芽。该方法利用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染苹果叶片，经共培养培养基和选择培养基培养后，得到便于观察区分的转基因不定根，然后经过含有吲哚‑3‑乙酸和噻苯隆的根生芽培养基培养，得到转基因再生芽；该方法具有高遗传转化率，低嵌合体频率的优点。

技术领域

本发明涉及生物基因技术领域，具体为基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法。

背景技术

大力发展生物育种是解决我国当前苹果产业对优质新品种迫切需求的有效途径，建立高效遗传转化体系是进行生物育种的必要前提。

目前苹果遗传转化主要依靠根癌农杆菌介导的侵染方法实现。该方法受到明显的基因型限制，目前只在“嘎啦”和“金冠”等少数几个品种中有成功案例的报道，且存在转化效率低、嵌合体频率高的缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法。

本发明技术方案如下：

基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，包括如下操作：

步骤1：取苹果叶片作为外植体；

步骤2：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，得侵染叶片；

步骤3：将所述侵染叶片置于共培养培养基和选择培养基中，进行生根培养，得不定根；

步骤4：将所述不定根置于含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，进行生芽培养，得再生芽。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，所述吲哚-3-乙酸的浓度为0.01-0.2mg/mL，所述噻苯隆浓度为1-3mg/mL。

其中，所述含有吲哚-3-乙酸和噻苯隆的根生芽培养基中，所述吲哚-3-乙酸浓度为0.2mg/mL，所述噻苯隆浓度为2mg/mL。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述步骤3的具体操作为：将所述侵染叶片吸干水分后，叶背朝下置于共培养培养基中，24-26℃黑暗培养3天；接着，叶腹朝下置于选择培养基中，24-26℃黑暗培养17-18天；然后，置于选择培养基中，24-26℃黑暗培养40-42天，得所述不定根。

其中，所述共培养培养基中含有以下成分：1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂。

其中，获得所述选择培养基的具体操作为：将1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸、30g/L蔗糖和8g/L琼脂混合，调pH至5.8，灭菌后，加入200mg/L特美汀，倒板，得所述选择培养基。

如上所述的基于发根农杆菌侵染和转分化实现的苹果遗传转化方法，所述步骤2的具体操作为：将所述外植体使用含有转基因质粒的发根农杆菌菌液侵染，加入乙酰丁香酮，混合侵染后，用悬浮液洗，得所述侵染叶片；所述悬浮液包括以下浓度的物质：1/2MS培养基、0.25mg/L吲哚丁酸和30g/L蔗糖。

其中，获得所述含有转基因质粒的发根农杆菌菌液的具体操作为：

取农杆菌菌株置于液体培养基中，28℃摇菌12h，得菌液；

将所述菌液加入液体培养基中，摇菌5h至OD600＝0.6，5000rpm离心5min，得菌块；