[发明专利]用于鼠疫耶尔森菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用

说明书

本发明公开了用于鼠疫耶尔森菌的CRISPR‑Cas12a检测引物组及其应用。本发明提供了用于检测鼠疫耶尔森菌的CRISPR‑Cas12a系统，还提供了用于特异性扩增第一方面中所述鼠疫耶尔森菌靶点序列的RAA扩增引物；作为荧光报告分子的探针。本发明基于鼠疫耶尔森氏菌及其近缘物种的全基因组比对获取鼠疫耶尔森氏菌特异性基因序列，进一步利用特异性基因序列设计RAA扩增引物和crRNA序列对鼠疫耶尔森氏菌进行检测，并开发相关试剂盒。本发明可特异检测鼠疫耶尔森氏菌，将其与其他近缘物种区分；具有快速、简便、准确的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于鼠疫耶尔森菌的CRISPR-Cas12a检测引物组及其应用，更加具体的涉及用于鼠疫耶尔森菌的CRISPR-Cas12a检测引物、crRNA及其用途。

背景技术

鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)是一种杆菌，属于耶尔森氏菌属，其作为腺鼠疫、肺鼠疫和败血型鼠疫的病媒，被认为是世界上最致命的病原菌之一。在人类历史上，从公元前3世纪到19世纪末，世界各地曾先后发生过3次鼠疫大流行，死亡人数数以亿计。在我国，鼠疫被列为甲类传染病。鼠疫作为一种烈性传染病，具有传播快、病死率高等特点，因此被认为是一种经典的生物战剂或生物恐怖主义制剂。我国的许多地区是鼠疫自然疫源地，鼠疫的发生和流行直接关系到人群健康。因此，无论是预防还是治疗，都需要开发一种快速、灵敏和特异的方法来检测鼠疫耶尔森菌。经典的鼠疫耶尔森菌检测方法，包括分离培养、pcr技术、全基因组和宏基因组测序等，这些方法虽然在检测鼠疫耶尔森氏菌方面固然起着重要作用，但同时具有费时费力、时间周期长且效率低、需要专业人员及昂贵仪器、假阳性率高、不适于临场快速检测等问题。对位于贫困地区的鼠疫疫源地进行长期监测，以预测啮齿动物未来的流行病和人类的接触风险，或对现场怀疑有生物恐怖行为的样本进行调查以及疫苗质量监控等，需要开发一种简单、快速和有效的检测方法。

CRISPR-Cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，CRISPR-Cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，Ⅱ类Cas蛋白如Cas12a蛋白具有的“附属切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。

重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是一种等温扩增新技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。其在国内基于开发的公司及使用酶来源等的差异，又被命名为重组酶介导等温扩增技术(Recombinase AidedAmplification，RAA，江苏奇天基因生物科技有限公司、杭州众测生物科技有限公司)或酶促恒温扩增技术(Enzymatic Recombinase Amplification，ERA，苏州先达基因科技有限公司)等。RAA用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(PCR)所需的热循环。不同于许多其他等温技术，RAA省去了升高或精确控温阶段，扩增反应在25～42℃的温度范围内均可进行，反应通常在5～15min内完成。RAA技术自一出现就崭露头角，因其具有反应迅速(5～15min)、特异性强(引物)、低温运行(25～42℃)、样本容差(对样本类型的要求特别宽松)、灵敏度高(单拷贝)、适用性广、试剂形态灵活(液态试剂或干粉)和检测形式多样等优势，在核酸检测领域得到了广泛应用。

将CRISPR-Cas12a检测系统与RAA技术结合，通过RAA技术常温扩增目的片段，然后进行CRISPR-Cas12a检测反应，此结合的意义在于RAA预先扩增可以弥补CRISPR-Cas12a检测灵敏度不高的缺陷，同时利用CRISPR-Cas12a检测的特异性保证检测结果的准确性，达到优势互补，提高检测效果的目的。